Дякуємо за відвідування сайту nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращої роботи рекомендуємо використовувати останню версію браузера (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Крім того, для забезпечення постійної підтримки цей сайт не використовуватиме стилі та JavaScript.
Скелетні м'язи – це гетерогенна тканина, що складається переважно з міофібрил, які у людини зазвичай класифікуються на три типи: один «повільний» (тип 1) та два «швидкі» (типи 2A та 2X). Однак гетерогенність між традиційними типами міофібрил та всередині них залишається недостатньо вивченою. Ми застосували транскриптомний та протеомний підходи до 1050 та 1038 окремих міофібрил з латерального широкого м'яза спинного мозку людини відповідно. Протеомне дослідження включало чоловіків, а транскриптомне дослідження – 10 чоловіків та 2 жінки. Окрім ізоформ важкого ланцюга міозину, ми визначили метаболічні білки, рибосомні білки та клітинні сполучні білки як джерела багатовимірної мінливості між міофібрил. Крім того, незважаючи на ідентифікацію кластерів повільних та швидких волокон, наші дані свідчать про те, що волокна типу 2X фенотипічно не відрізняються від інших швидкоскорочуючихся волокон. Крім того, класифікації на основі важкого ланцюга міозину недостатньо для опису фенотипу міофібрил при немалінових міопатіях. Загалом, наші дані свідчать про багатовимірну гетерогенність міофібрил, причому джерела варіацій виходять за межі ізоформ важкого ланцюга міозину.
Клітинна гетерогенність є невід'ємною рисою всіх біологічних систем, що дозволяє клітинам спеціалізуватися для задоволення різних потреб тканин і клітин.1 Традиційний погляд на гетерогенність волокон скелетних м'язів полягає в тому, що рухові нейрони визначають тип волокна в межах рухової одиниці, і що тип волокна (тобто тип 1, тип 2A та тип 2X у людини) визначається характеристиками ізоформ важкого ланцюга міозину (MYH).2 Спочатку це базувалося на їх нестабільності pH-АТФази,3,4 а пізніше на їх молекулярній експресії MYH.5 Однак, з ідентифікацією та подальшим прийняттям «змішаних» волокон, які коекспресують кілька MYH у різних пропорціях, волокна скелетних м'язів все частіше розглядаються як континуум, а не як окремі типи волокон.6 Незважаючи на це, ця галузь все ще значною мірою покладається на MYH як основний класифікатор для класифікації міофібрил, що, ймовірно, залежить від обмежень та значних упереджень ранніх досліджень на гризунах, профілі експресії MYH та діапазон типів волокон яких відрізняються від таких у людей.2 Ситуація ще більше ускладнюється тим фактом, що різні скелетні м'язи людини демонструють різноманітний діапазон типів волокон.7 Широкий м'яз lateralis – це змішаний м’яз із проміжним (і тому репрезентативним) профілем експресії MYH.7 Крім того, легкість відбору проб робить його найкраще вивченим м’язом у людини.
Таким чином, неупереджене дослідження різноманітності волокон скелетних м'язів за допомогою потужних інструментів «оміки» є критично важливим, але також складним, частково через багатоядерну природу волокон скелетних м'язів. Однак технології транскриптоміки8,9 та протеоміки10 зазнали революції в чутливості в останні роки завдяки різним технологічним досягненням, що дозволяє аналізувати скелетні м'язи з роздільною здатністю окремих волокон. В результаті було досягнуто значного прогресу в характеристиці різноманітності окремих волокон та їхньої реакції на атрофічні подразники та старіння11,12,13,14,15,16,17,18. Важливо, що ці технологічні досягнення мають клінічне застосування, що дозволяє більш детально та точно характеризувати пов'язану з захворюваннями дисрегуляцію. Наприклад, патофізіологія немалінової міопатії, одного з найпоширеніших спадкових захворювань м'язів (MIM 605355 та MIM 161800), є складною та заплутаною.19,20 Тому краща характеристика дисрегуляції волокон скелетних м'язів може призвести до значного прогресу в нашому розумінні цього захворювання.
Ми розробили методи транскриптомного та протеомного аналізу окремих волокон скелетних м'язів, вручну виділених із зразків біопсії людини, та застосували їх до тисяч волокон, що дозволило нам дослідити клітинну гетерогенність волокон скелетних м'язів людини. У ході цієї роботи ми продемонстрували можливості транскриптомного та протеомного фенотипування м'язових волокон та визначили метаболічні, рибосомні та клітинні сполучні білки як значні джерела міжволокнистої мінливості. Крім того, використовуючи цей протеомний робочий процес, ми охарактеризували клінічну значущість нематодної міопатії в окремих волокнах скелетних м'язів, виявивши скоординований зсув у бік неокислювальних волокон незалежно від типу волокон на основі мієломи мієломи (MYH).
Щоб дослідити гетерогенність волокон скелетних м'язів людини, ми розробили два робочі процеси, що дозволяють проводити транскриптомний та протеомний аналіз окремих волокон скелетних м'язів (Рисунок 1A та Додатковий Рисунок 1A). Ми розробили та оптимізували кілька методологічних кроків, від зберігання зразків та збереження цілісності РНК і білків до оптимізації пропускної здатності для кожного підходу. Для аналізу транскриптомів це було досягнуто шляхом вставки специфічних для зразка молекулярних штрих-кодів на початковому етапі зворотної транскрипції, що дозволило об'єднати 96 волокон для ефективної подальшої обробки. Глибше секвенування (±1 мільйон зчитувань на волокно) порівняно з традиційними підходами до окремих клітин ще більше збагатило дані транскриптомів.21 Для протеоміки ми використовували короткий хроматографічний градієнт (21 хвилина) у поєднанні зі збором даних DIA-PASEF на мас-спектрометрі timsTOF для оптимізації глибини протеому, зберігаючи при цьому високу пропускну здатність. 22,23 Щоб дослідити гетерогенність здорових волокон скелетних м'язів, ми охарактеризували транскриптоми 1050 окремих волокон від 14 здорових дорослих донорів та протеоми 1038 волокон від 5 здорових дорослих донорів (Додаткова таблиця 1). У цій роботі ці набори даних називаються транскриптомами та протеомами з 1000 волокон відповідно. Наш підхід виявив загалом 27 237 транскриптів та 2983 білки в транскриптомному та протеомному аналізі 1000 волокон (Рисунок 1A, Додаткові набори даних 1–2). Після фільтрації транскриптомних та протеомних наборів даних для >1000 виявлених генів та 50% достовірних значень на волокно, подальші біоінформатичні аналізи були проведені для 925 та 974 волокон у транскриптомі та протеомі відповідно. Після фільтрації на одне волокно було виявлено в середньому 4257 ± 1557 генів та 2015 ± 234 білки (середнє ± стандартне відхилення) з обмеженою міжіндивідуальною варіабельністю (Додаткові рисунки 1B–C, Додаткові набори даних 3–4). Однак, внутрішньосуб'єктна варіабельність була більш вираженою серед учасників, ймовірно, через відмінності у виході РНК/білка між волокнами різної довжини та площі поперечного перерізу. Для більшості білків (>2000) коефіцієнт варіації був нижче 20% (Додатковий рисунок 1D). Обидва методи дозволили охопити широкий динамічний діапазон транскриптів та білків з високо експресованими сигнатурами, важливими для скорочення м'язів (наприклад, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Додаткові рисунки 1E–F). Більшість виявлених ознак були спільними для транскриптомних та протеомних наборів даних (Додатковий рисунок 1G), а середня інтенсивність UMI/LFQ цих ознак була досить добре корельованою (r = 0,52) (Додатковий рисунок 1H).
Робочий процес з транскриптоміки та протеоміки (створено за допомогою BioRender.com). BD Криві динамічного діапазону для MYH7, MYH2 та MYH1, а також розраховані пороги для визначення типу волокон. E, F Розподіл експресії MYH по волокнах у наборах даних транскриптоміки та протеоміки. G, H Діаграми наближення та проекції рівномірної різноманітності (UMAP) для транскриптоміки та протеоміки, забарвлені за типом волокон на основі MYH. I, J Діаграми характеристик, що показують експресію MYH7, MYH2 та MYH1 у наборах даних транскриптоміки та протеоміки.
Спочатку ми мали на меті призначити кожному волокну тип волокна на основі MYH, використовуючи оптимізований підхід, який використовує високу чутливість та динамічний діапазон експресії MYH в наборах даних omics. У попередніх дослідженнях використовувалися довільні пороги для позначення волокон як чистих типів 1, 2A, 2X або змішаних на основі фіксованого відсотка експресії різних MYH11,14,24. Ми використали інший підхід, за якого експресія кожного волокна ранжувалася за MYH, які ми використовували для типізації волокон: MYH7, MYH2 та MYH1, що відповідають волокнам типу 1, 2A та 2X відповідно. Потім ми математично розрахували нижню точку перегину кожної отриманої кривої та використали її як поріг для призначення волокон як позитивних (вище порогу) або негативних (нижче порогу) для кожного MYH (Рисунок 1B–D). Ці дані демонструють, що MYH7 (Рисунок 1B) та MYH2 (Рисунок 1C) мають більш чіткі профілі експресії on/off на рівні РНК порівняно з рівнем білка. Дійсно, на рівні білка дуже мало волокон не експресували MYH7, і жодне волокно не мало 100% експресії MYH2. Далі ми використали заздалегідь визначені пороги експресії, щоб віднести типи волокон на основі MYH до всіх волокон у кожному наборі даних. Наприклад, волокна MYH7+/MYH2-/MYH1- були віднесені до типу 1, тоді як волокна MYH7-/MYH2+/MYH1+ були віднесені до змішаного типу 2A/2X (повний опис див. у Додатковій таблиці 2). Об'єднавши всі волокна, ми спостерігали надзвичайно схожий розподіл типів волокон на основі MYH як на рівні РНК (Рисунок 1E), так і на рівні білка (Рисунок 1F), тоді як відносний склад типів волокон на основі MYH варіювався у різних осіб, як і очікувалося (Додатковий рисунок 2A). Більшість волокон були класифіковані як чистий тип 1 (34–35%) або тип 2A (36–38%), хоча також була виявлена значна кількість змішаних волокон типу 2A/2X (16–19%). Вражаюча відмінність полягає в тому, що чисті волокна типу 2X можна було виявити лише на рівні РНК, але не на рівні білка, що свідчить про те, що швидка експресія MYH принаймні частково регулюється посттранскрипційно.
Ми валідували наш метод типізації волокон MYH на основі протеоміки за допомогою точкового блоттингу на основі антитіл, і обидва методи досягли 100% згоди в ідентифікації чистих волокон типу 1 та типу 2A (див. Додатковий рисунок 2B). Однак, підхід на основі протеоміки був чутливішим, ефективнішим у ідентифікації змішаних волокон та кількісному визначенні частки кожного гена MYH у кожному волокні. Ці дані демонструють ефективність використання об'єктивного, високочутливого підходу на основі оміки для характеристики типів волокон скелетних м'язів.
Потім ми використали об'єднану інформацію, надану транскриптомікою та протеомікою, для об'єктивної класифікації міофібрил на основі їх повного транскриптома або протеома. Використовуючи метод апроксимації та проекції рівномірного многовиду (UMAP) для зменшення розмірності до шести головних компонентів (Додаткові рисунки 3A–B), ми змогли візуалізувати мінливість міофібрил у транскриптомі (Рисунок 1G) та протеомі (Рисунок 1H). Примітно, що міофібрили не були згруповані за учасниками (Додаткові рисунки 3C–D) або днями тестування (Додатковий рисунок 3E) ні в наборах даних транскриптоміки, ні в наборах даних протеоміки, що свідчить про те, що внутрішньосуб'єктна мінливість у скелетних м'язових волокнах вища, ніж міжсуб'єктна мінливість. На графіку UMAP з'явилися два окремі кластери, що представляють «швидкі» та «повільні» міофібрили (Рисунки 1G–H). Міофібри MYH7+ (повільні) були згруповані на позитивному полюсі UMAP1, тоді як міофібри MYH2+ та MYH1+ (швидкі) були згруповані на негативному полюсі UMAP1 (рисунки 1I–J). Однак, не було зроблено розрізнення між типами швидких волокон (тобто тип 2A, тип 2X або змішані 2A/2X) на основі експресії MYH, що свідчить про те, що експресія MYH1 (рисунок 1I–J) або інших класичних маркерів 2X міофібрил, таких як ACTN3 або MYLK2 (додаткові рисунки 4A–B), не розрізняє різні типи міофібрил, якщо розглядати весь транскриптом або протеом. Більше того, порівняно з MYH2 та MYH7, мало транскриптів або білків позитивно корелювали з MYH1 (додаткові рисунки 4C–H), що свідчить про те, що кількість MYH1 не повністю відображає транскриптом/протеом міофібрил. Подібні висновки були зроблені при оцінці змішаної експресії трьох ізоформ MYH на рівні UMAP (Додаткові рис. 4I–J). Таким чином, хоча волокна 2X можна ідентифікувати на рівні транскрипту лише на основі кількісного визначення MYH, волокна MYH1+ не відрізняються від інших швидких волокон, якщо розглядати весь транскриптом або протеом.
Як початкове дослідження гетерогенності повільних волокон поза межами MYH, ми оцінили чотири встановлені типоспецифічні білки повільних волокон: TPM3, TNNT1, MYL3 та ATP2A22. Підтипи повільних волокон показали високі, хоча й не ідеальні, кореляції Пірсона з MYH7 як у транскриптоміці (Додатковий рисунок 5A), так і в протеоміці (Додатковий рисунок 5B). Приблизно 25% та 33% повільних волокон не були класифіковані як чисті повільні волокна за всіма підтипами генів/білків у транскриптоміці (Додатковий рисунок 5C) та протеоміці (Додатковий рисунок 5D) відповідно. Отже, класифікація повільних волокон на основі кількох підтипів генів/білків вносить додаткову складність, навіть для білків, які, як відомо, є типоспецифічними для волокон. Це свідчить про те, що класифікація волокон на основі ізоформ однієї родини генів/білків може неадекватно відображати справжню гетерогенність волокон скелетних м'язів.
Для подальшого дослідження фенотипічної мінливості волокон скелетних м'язів людини в масштабі всієї омікової моделі, ми виконали неупереджене зменшення розмірності даних за допомогою аналізу головних компонентів (PCA) (Рисунок 2A). Подібно до графіків UMAP, ні учасник, ні день тестування не впливали на кластеризацію волокон на рівні PCA (Додаткові рисунки 6A–C). В обох наборах даних тип волокон на основі MYH був пояснений PC2, який показав кластер повільних волокон типу 1 та другий кластер, що містив швидкі волокна типу 2A, типу 2X та змішані волокна 2A/2X (Рисунок 2A). В обох наборах даних ці два кластери були з'єднані невеликою кількістю змішаних волокон типу 1/2A. Як і очікувалося, аналіз надмірної представленості основних факторів PC підтвердив, що PC2 керується скоротливими та метаболічними сигнатурами (Рисунок 2B та Додаткові рисунки 6D–E, Додаткові набори даних 5–6). Загалом, тип волокон на основі MYH виявився достатнім для пояснення безперервної варіації вздовж PC2, за винятком так званих 2X-волокон, які були розподілені по всьому транскриптому в межах швидкого кластера.
A. Діаграми аналізу головних компонент (PCA) наборів даних транскриптома та протеому, забарвлені відповідно до типу волокна на основі MYH. B. Аналіз збагачення драйверів транскриптів та білків у PC2 та PC1. Статистичний аналіз було проведено з використанням пакета clusterProfiler та p-значень, скоригованих за Бенджаміні-Хохбергом. C, D. Діаграми PCA, забарвлені відповідно до термінів онтології генів (GO) міжклітинної адгезії в транскриптомі та термінів GO костамеру в протеомі. Стрілки позначають драйвери транскриптів та білків та їх напрямки. E, F. Діаграми апроксимації та проекції рівномірного многовиду (UMAP) характеризують клінічно значущі ознаки, що показують градієнти експресії незалежно від типу повільних/швидких волокон. G, H. Кореляції між драйверами PC2 та PC1 у транскриптомах та протеомах.
Несподівано, тип міофібрил на основі MYH пояснив лише другий за величиною ступінь варіабельності (PC2), що свідчить про те, що інші біологічні фактори, не пов'язані з типом міофібрил на основі MYH (PC1), відіграють важливу роль у регуляції гетерогенності волокон скелетних м'язів. Аналіз надмірної представленості головних факторів у PC1 показав, що варіабельність у PC1 в першу чергу визначалася міжклітинною адгезією та вмістом рибосом у транскриптомі, а також костамерами та рибосомними білками в протеомі (Рисунок 2B та Додаткові Рисунки 6D–E, Додатковий набір даних 7). У скелетних м'язах костамери з'єднують Z-диск із сарколемою та беруть участь у передачі сили та сигналізації.25 Анотовані графіки PCA з використанням ознак міжклітинної адгезії (транскриптом, Рисунок 2C) та костамерів (протеом, Рисунок 2D) виявили сильний зсув ліворуч у PC1, що вказує на те, що ці ознаки збагачені певними волокнами.
Більш детальне дослідження кластеризації міофібрил на рівні UMAP показало, що більшість ознак демонстрували незалежний від типу міофібрил градієнт експресії на основі MYH, а не специфічний для субкластерів міофібрил. Ця безперервність спостерігалася для кількох генів, пов'язаних з патологічними станами (Рисунок 2E), таких як CHCHD10 (нервово-м'язові захворювання), SLIT3 (м'язова атрофія), CTDNEP1 (м'язові захворювання). Ця безперервність також спостерігалася по всьому протеому, включаючи білки, пов'язані з неврологічними розладами (UGDH), інсуліновою сигналізацією (PHIP) та транскрипцією (HIST1H2AB) (Рисунок 2F). У сукупності ці дані вказують на безперервність у неоднорідності повільних/швидких посмикувань, незалежної від типу волокон, у різних міофібрилах.
Цікаво, що гени-драйвери в PC2 показали добру кореляцію транскриптом-протеом (r = 0,663) (Рисунок 2G), що свідчить про те, що повільні та швидкі типи волокон, і зокрема скоротливі та метаболічні властивості волокон скелетних м'язів, регулюються транскрипцією. Однак гени-драйвери в PC1 не показали кореляції транскриптом-протеом (r = -0,027) (Рисунок 2H), що свідчить про те, що варіації, не пов'язані з повільними/швидкими типами волокон, значною мірою регулюються посттранскрипційно. Оскільки варіації в PC1 пояснювалися переважно термінами онтології рибосомних генів, і враховуючи, що рибосоми відіграють вирішальну та спеціалізовану роль у клітині, активно беручи участь у трансляції білків та впливаючи на неї,31 ми далі поставили собі за мету дослідити цю неочікувану гетерогенність рибосом.
Спочатку ми розфарбували графік аналізу головних компонентів протеоміки відповідно до відносної кількості білків у терміні GOCC «цитоплазматична рибосома» (Рисунок 3A). Хоча цей термін збагачений на позитивній стороні PC1, що призводить до невеликого градієнта, рибосомні білки керують розподілом в обох напрямках PC1 (Рисунок 3A). Рибосомні білки, збагачені на негативній стороні PC1, включали RPL18, RPS18 та RPS13 (Рисунок 3B), тоді як RPL31, RPL35 та RPL38 (Рисунок 3C) були основними рушійними силами на позитивній стороні PC1. Цікаво, що RPL38 та RPS13 були високо експресовані в скелетних м'язах порівняно з іншими тканинами (Додатковий Рисунок 7A). Ці відмінні рибосомні сигнатури в PC1 не спостерігалися в транскриптомі (Додатковий Рисунок 7B), що вказує на посттранскрипційну регуляцію.
A. Графік аналізу головних компонент (PCA), забарвлений відповідно до термінів цитоплазматичної рибосомної генної онтології (GO) по всьому протеому. Стрілки вказують напрямок білково-опосередкованої варіації на графіку PCA. Довжина лінії відповідає оцінці головних компонент для даного білка. B, C. Графіки характеристик PCA для RPS13 та RPL38. D. Неконтрольований ієрархічний кластерний аналіз цитоплазматичних рибосомних білків. E. Структурна модель 80S рибосоми (PDB: 4V6X), що виділяє рибосомні білки з різною кількістю у волокнах скелетних м'язів. F. Рибосомні білки з різною стехіометрією, локалізовані поблизу каналу виходу мРНК.
Концепції гетерогенності та спеціалізації рибосом були запропоновані раніше, згідно з якими наявність різних субпопуляцій рибосом (гетерогенність рибосом) може безпосередньо впливати на трансляцію білків у різних тканинах32 та клітинах33 шляхом селективної трансляції специфічних пулів транскриптів мРНК34 (спеціалізація рибосом). Щоб ідентифікувати субпопуляції рибосомних білків, що коекспресуються у волокнах скелетних м'язів, ми провели неконтрольований ієрархічний кластерний аналіз рибосомних білків у протеомі (Рисунок 3D, Додатковий набір даних 8). Як і очікувалося, рибосомні білки не кластеризувались за типом волокон на основі MYH. Однак ми ідентифікували три різні кластери рибосомних білків; перший кластер (ribosomal_cluster_1) корегулюється з RPL38 і, отже, має підвищену експресію у волокнах з позитивним профілем PC1. Другий кластер (ribosomal_cluster_2) корегулюється з RPS13 і підвищений у волокнах з негативним профілем PC1. Третій кластер (ribosomal_cluster_3) не демонструє скоординованої диференціальної експресії у волокнах скелетних м'язів і може вважатися «основним» рибосомним білком скелетних м'язів. Обидва рибосомні кластери 1 та 2 містять рибосомні білки, які, як раніше було показано, регулюють альтернативну трансляцію (наприклад, RPL10A, RPL38, RPS19 та RPS25) та функціонально впливають на розвиток (наприклад, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Відповідно до результатів PCA, спостережувана гетерогенна репрезентація цих рибосомних білків по волокнах також показала безперервність (Додатковий Рисунок 7C).
Для візуалізації розташування гетерогенних рибосомних білків у рибосомі ми використали структурну модель людської 80S рибосоми (Protein Data Bank: 4V6X) (Рисунок 3E). Після виділення рибосомних білків, що належать до різних рибосомних кластерів, їх розташування не було тісно пов'язане, що свідчить про те, що наш підхід не зміг забезпечити збагачення певних регіонів/фракціон рибосоми. Цікаво, однак, що частка білків великих субодиниць у кластері 2 була нижчою, ніж у кластерах 1 та 3 (Додатковий Рисунок 7D). Ми спостерігали, що білки зі зміненою стехіометрією у волокнах скелетних м'язів переважно локалізувалися на поверхні рибосоми (Рисунок 3E), що узгоджується з їхньою здатністю взаємодіяти з елементами внутрішнього сайту входу рибосоми (IRES) у різних популяціях мРНК, тим самим координуючи селективну трансляцію.40,41 Крім того, багато білків зі зміненою стехіометрією у волокнах скелетних м'язів були розташовані поблизу функціональних регіонів, таких як тунель виходу мРНК (Рисунок 3F), які вибірково регулюють трансляційне подовження та арешт специфічних пептидів. 42 Підсумовуючи, наші дані свідчать про те, що стехіометрія рибосомних білків скелетних м'язів демонструє гетерогенність, що призводить до відмінностей між волокнами скелетних м'язів.
Далі ми поставили собі за мету ідентифікувати сигнатури швидко- та повільноскорочуваних волокон і дослідити механізми їхньої транскрипційної регуляції. Порівнюючи кластери швидко- та повільноскорочуваних волокон, визначені за допомогою UMAP у двох наборах даних (рисунки 1G–H та 4A–B), транскриптомний та протеомний аналізи виявив 1366 та 804 диференційно поширені ознаки відповідно (рисунки 4A–B, додаткові набори даних 9–12). Ми спостерігали очікувані відмінності в сигнатурах, пов'язаних із саркомерами (наприклад, тропоміозин та тропонін), зв'язком збудження-скорочення (ізоформи SERCA) та енергетичним метаболізмом (наприклад, ALDOA та CKB). Крім того, транскрипти та білки, що регулюють убиквітинування білків, диференційно експресувалися у швидко- та повільноскорочуваних волокнах (наприклад, USP54, SH3RF2, USP28 та USP48) (рисунки 4A–B). Більше того, ген мікробного білка RP11-451G4.2 (DWORF), який раніше, як було показано, диференційно експресується в різних типах м'язових волокон ягняти43 та посилює активність SERCA в серцевому м'язі44, був значно підвищений у повільних скелетних м'язових волокнах (Рисунок 4A). Аналогічно, на рівні окремих волокон, значні відмінності спостерігалися у відомих сигнатурах, таких як ізоформи лактатдегідрогенази, пов'язані з метаболізмом (LDHA та LDHB, Рисунок 4C та Додатковий Рисунок 8A)45,46, а також раніше невідомі сигнатури, специфічні для типу волокон (такі як IRX3, USP54, USP28 та DPYSL3) (Рисунок 4C). Спостерігалося значне перекриття диференційно експресованих ознак між транскриптомними та протеомними наборами даних (Додатковий Рисунок 8B), а також кореляція кратності зміни, зумовлена головним чином більш вираженою диференціальною експресією ознак саркомера (Додатковий Рисунок 8C). Примітно, що деякі сигнатури (наприклад, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) демонстрували сильну посттранскрипційну регуляцію лише на протеомному рівні та мали специфічні для типу волокон повільного/швидкого посмикування профілі експресії (Додатковий Рисунок 8C).
A та B діаграми вулканів, що порівнюють повільні та швидкі кластери, ідентифіковані за допомогою графіків апроксимації та проекції рівномірного многовиду (UMAP) на рисунках 1G–H. Кольорові точки представляють транскрипти або білки, які суттєво відрізняються при FDR < 0,05, а темніші точки представляють транскрипти або білки, які суттєво відрізняються при логарифмічній зміні > 1. Двофакторний статистичний аналіз проводили за допомогою тесту Вальда DESeq2 зі скоригованими за Бенджаміні-Хохбергом p-значеннями (транскриптоміка) або методу лінійної моделі Лімми з емпіричним байєсівським аналізом з подальшим коригуванням за Бенджаміні-Хохбергом для множинних порівнянь (протеоміка). C Діаграми сигнатур вибраних диференційно експресованих генів або білків між повільними та швидкими волокнами. D Аналіз збагачення суттєво диференційно експресованих транскриптів та білків. Значення, що перекриваються, збагачені в обох наборах даних, значення транскриптому збагачені лише в транскриптомі, а значення протеому збагачені лише в протеомі. Статистичний аналіз проводили за допомогою пакета clusterProfiler зі скоригованими за Бенджаміні-Хохбергом p-значеннями. E. Специфічні для типу волокон транскрипційні фактори, ідентифіковані SCENIC на основі отриманих SCENIC балів специфічності регуляторів та диференціальної експресії мРНК між типами волокон. F. Профілювання вибраних транскрипційних факторів, диференціально експресованих між повільними та швидкими волокнами.
Потім ми провели аналіз надмірної репрезентації диференційно представлених генів та білків (Рисунок 4D, Додатковий набір даних 13). Збагачення шляхів для ознак, що відрізнялися між двома наборами даних, виявило очікувані відмінності, такі як процеси β-окислення жирних кислот та метаболізму кетонів (повільні волокна), скорочення міофіламентів/м'язів (швидкі та повільні волокна відповідно) та катаболічні процеси вуглеводів (швидкі волокна). Активність серин/треонінової протеїнфосфатази також була підвищена у швидких волокнах, що зумовлено такими ознаками, як регуляторна та каталітична субодиниці фосфатази (PPP3CB, PPP1R3D та PPP1R3A), які, як відомо, регулюють метаболізм глікогену (47) (Додаткові рисунки 8D–E). Інші шляхи, збагачені швидкими волокнами, включали процесингові (P-) тільця (YTHDF3, TRIM21, LSM2) у протеомі (Додатковий рис. 8F), потенційно залучені до посттранскрипційної регуляції (48), та активність транскрипційних факторів (SREBF1, RXRG, RORA) у транскриптомі (Додатковий рис. 8G). Повільні волокна були збагачені активністю оксидоредуктази (BDH1, DCXR, TXN2) (Додатковий рис. 8H), зв'язуванням аміду (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Додатковий рис. 8I), позаклітинним матриксом (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Додатковий рис. 8J) та рецептор-лігандною активністю (FNDC5, SPX, NENF) (Додатковий рис. 8K).
Щоб глибше зрозуміти транскрипційну регуляцію, що лежить в основі характеристик типу повільних/швидких м'язових волокон, ми провели аналіз збагачення транскрипційних факторів за допомогою SCENIC49 (Додатковий набір даних 14). Багато транскрипційних факторів були значно збагачені між швидкими та повільними м'язовими волокнами (Рисунок 4E). Це включало транскрипційні фактори, такі як MAFA, який раніше пов'язували з розвитком швидких м'язових волокон,50 а також кілька транскрипційних факторів, які раніше не пов'язували зі специфічними для типу м'язових волокон генними програмами. Серед них PITX1, EGR1 та MYF6 були найбільш збагаченими транскрипційними факторами у швидких м'язових волокнах (Рисунок 4E). На противагу цьому, ZSCAN30 та EPAS1 (також відомий як HIF2A) були найбільш збагаченими транскрипційними факторами у повільних м'язових волокнах (Рисунок 4E). Відповідно до цього, MAFA експресувався на вищих рівнях в області UMAP, що відповідає швидким м'язовим волокнам, тоді як EPAS1 мав протилежний патерн експресії (Рисунок 4F).
Окрім відомих генів, що кодують білки, існує безліч біотипів некодуючих РНК, які можуть бути задіяні в регуляції розвитку та захворювань людини.51, 52 У наборах даних транскриптомів кілька некодуючих РНК демонструють специфічність до типу волокон (Рисунок 5A та Додатковий набір даних 15), включаючи LINC01405, яка є високоспецифічною для повільних волокон і, як повідомляється, знижена в м'язах пацієнтів з мітохондріальною міопатією.53 На противагу цьому, RP11-255P5.3, що відповідає гену lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)54, демонструє специфічність до типу швидких волокон. Як LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), так і RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) демонструють специфічність до скелетних м'язів (Додаткові Рисунки 9A–B) і не мають відомих скоротливих генів у своєму геномному оточенні розміром 1 Мб, що свідчить про те, що вони відіграють спеціалізовану роль у регуляції типів волокон, а не в регуляції сусідніх скоротливих генів. Специфічні профілі експресії повільних/швидких типів волокон LINC01405 та RP11-255P5.3 відповідно були підтверджені за допомогою RNAscope (Рисунки 5B–C).
A. Транскрипти некодуючих РНК значно регулюються в повільних та швидких м'язових волокнах. B. Типові зображення RNAscope, що показують специфічність LINC01405 та RP11-255P5.3 до повільних та швидких м'язових волокон відповідно. Масштабна шкала = 50 мкм. C. Кількісна оцінка експресії некодуючої РНК, специфічної для типу міофібрил, визначеної за допомогою RNAscope (n = 3 біопсії від незалежних осіб, порівнюючи швидкі та повільні м'язові волокна в межах кожної особи). Статистичний аналіз проводили за допомогою двостороннього t-критерію Стьюдента. Коробчасті діаграми показують медіану та перший і третій квартилі, причому вуса вказують на мінімальні та максимальні значення. D. Робочий процес ідентифікації мікробних білків de novo (створений за допомогою BioRender.com). E. Мікробний білок LINC01405_ORF408:17441:17358 специфічно експресується в повільних скелетних м'язових волокнах (n = 5 біопсій від незалежних учасників, порівнюючи швидкі та повільні м'язові волокна в межах кожного учасника). Статистичний аналіз було проведено з використанням методу лінійної моделі Лімма в поєднанні з емпіричним байєсівським підходом, а потім методу Бенджаміні-Хохберга для множинних порівнянь з коригуванням p-значення. Коробчасті діаграми показують медіану, перший та третій квартилі, причому вуса вказують на максимальні/мінімальні значення.
Нещодавні дослідження показали, що багато ймовірних некодуючих транскриптів кодують транскрибовані мікробні білки, деякі з яких регулюють функцію м'язів.44, 55 Щоб ідентифікувати мікробні білки з потенційною специфічністю до типу волокон, ми виконали пошук у нашому наборі даних з 1000 протеомів волокон, використовуючи спеціальний файл FASTA, що містить послідовності некодуючих транскриптів (n = 305), знайдені в наборі даних з 1000 транскриптомів волокон (Рисунок 5D). Ми ідентифікували 197 мікробних білків з 22 різних транскриптів, 71 з яких диференційно регулювався між повільними та швидкими скелетними м'язовими волокнами (Додатковий Рисунок 9C та Додатковий Набір Даних 16). Для LINC01405 було ідентифіковано три продукти мікробних білків, один з яких показав подібну специфічність до повільних волокон, як і його транскрипт (Рисунок 5E та Додатковий Рисунок 9D). Таким чином, ми ідентифікували LINC01405 як ген, що кодує мікробний білок, специфічний для повільних скелетних м'язових волокон.
Ми розробили комплексний робочий процес для великомасштабної протеомної характеристики окремих м'язових волокон та визначили регулятори гетерогенності волокон у здорових станах. Ми застосували цей робочий процес, щоб зрозуміти, як немалінові міопатії впливають на гетерогенність волокон скелетних м'язів. Немалінові міопатії – це спадкові м'язові захворювання, які викликають м'язову слабкість і у дітей, що страждають на них, проявляються низкою ускладнень, включаючи респіраторний дистрес, сколіоз та обмежену рухливість кінцівок.19,20 Як правило, при немалінових міопатіях патогенні варіанти генів, таких як актин альфа 1 (ACTA1), призводять до переважання складу повільно скорочуваних міофібрил, хоча цей ефект є гетерогенним. Одним помітним винятком є тропонін Т1 немалінова міопатія (TNNT1), яка має переважання швидких волокон. Таким чином, краще розуміння гетерогенності, що лежить в основі дисрегуляції волокон скелетних м'язів, що спостерігається при немалінових міопатіях, може допомогти розгадати складний зв'язок між цими захворюваннями та типом міофібрил.
Порівняно зі здоровими контрольними групами (n=3 на групу), міофібрили, виділені від пацієнтів з немаліновою міопатією з мутаціями в генах ACTA1 та TNNT1, показали виражену атрофію або дистрофію міофібрил (Рисунок 6A, Додаткова таблиця 3). Це створило значні технічні труднощі для протеомного аналізу через обмежену кількість доступного матеріалу. Незважаючи на це, нам вдалося виявити 2485 білків у 272 скелетних міофібрилах. Після фільтрації щонайменше 1000 кількісно визначених білків на волокно, 250 волокон було піддано подальшому біоінформатичному аналізу. Після фільтрації було кількісно визначено в середньому 1573 ± 359 білків на волокно (Додатковий рисунок 10A, Додаткові набори даних 17–18). Примітно, що, незважаючи на значне зменшення розміру волокон, глибина протеома зразків пацієнтів з немаліновою міопатією була лише незначно зменшена. Більше того, обробка цих даних за допомогою наших власних файлів FASTA (включаючи некодувальні транскрипти) дозволила нам ідентифікувати п'ять мікробних білків у скелетних міофібрілонах пацієнтів з немаліновою міопатією (Додатковий набір даних 19). Динамічний діапазон протеому був значно ширшим, а загальні білки в контрольній групі добре корелювали з результатами попереднього аналізу протеому з 1000 волокон (Додатковий рис. 10B–C).
A. Мікроскопічні зображення, що показують атрофію або дистрофію волокон та переважання різних типів волокон на основі MYH у немалінових міопатіях (NM) ACTA1 та TNNT1. Масштабна шкала = 100 мкм. Щоб забезпечити відтворюваність фарбування у пацієнтів з ACTA1 та TNNT1, три біопсії пацієнтів були забарвлені два-три рази (чотири зрізи на випадок) перед відбором репрезентативних зображень. B. Пропорції типів волокон у учасників на основі MYH. C. Графік аналізу головних компонентів (PCA) скелетних м'язових волокон у пацієнтів з немаліновими міопатіями та контрольної групи. D. Скелетні м'язові волокна пацієнтів з немаліновими міопатіями та контрольної групи, спроектовані на графік PCA, визначений на основі 1000 проаналізованих волокон на рисунку 2. Наприклад, вулканічні графіки, що порівнюють відмінності між учасниками з немаліновими міопатіями ACTA1 та TNNT1 та контрольною групою, а також між учасниками з немаліновими міопатіями ACTA1 та TNNT1. Кольорові кола позначають білки, які суттєво відрізнялися при π < 0,05, а темні точки позначають білки, які суттєво відрізнялися при FDR < 0,05. Статистичний аналіз проводили з використанням методу лінійної моделі Лімми та емпіричних байєсівських методів, а потім коригували p-значення для множинних порівнянь за допомогою методу Бенджаміні-Хохберга. H. Аналіз збагачення білків, що значно диференційно експресуються по всьому протеому та у волокнах типу 1 та 2A. Статистичний аналіз проводили з використанням пакета clusterProfiler та скоригованих p-значень Бенджаміні-Хохбергом. I, J. Діаграми аналізу головних компонент (PCA), забарвлені термінами позаклітинного матриксу та мітохондріальної генної онтології (GO).
Оскільки немалінові міопатії можуть впливати на частку типів міофібрил, що експресують MYH, у скелетних м'язах,19,20 ми спочатку дослідили типи міофібрил, що експресують MYH, у пацієнтів з немаліновими міопатіями та контрольної групи. Ми визначили тип міофібрил за допомогою неупередженого методу, описаного раніше для аналізу 1000 міофібрил (Додаткові рис. 10D–E), і знову не змогли ідентифікувати чисті 2X міофібрили (Рисунок 6B). Ми спостерігали гетерогенний вплив немалінових міопатій на тип міофібрил, оскільки у двох пацієнтів з мутаціями ACTA1 була підвищена частка міофібрил 1 типу, тоді як у двох пацієнтів з немаліновою міопатією TNNT1 була знижена частка міофібрил 1 типу (Рисунок 6B). Дійсно, експресія MYH2 та ізоформ швидких тропонінів (TNNC2, TNNI2 та TNNT3) була знижена при ACTA1-немалінових міопатіях, тоді як експресія MYH7 була знижена при TNNT1-немалінових міопатіях (Додатковий Рисунок 11A). Це узгоджується з попередніми повідомленнями про гетерогенне перемикання типів міофібрил при немалінових міопатіях.19,20 Ми підтвердили ці результати за допомогою імуногістохімії та виявили, що у пацієнтів з ACTA1-немаліновою міопатією переважали міофібрили 1 типу, тоді як у пацієнтів з TNNT1-немаліновою міопатією спостерігалася протилежна картина (Рисунок 6A).
На рівні протеому окремих волокон волокна скелетних м'язів від пацієнтів з немаліновою міопатією ACTA1 та TNNT1 згрупувалися з більшістю контрольних волокон, причому волокна немалінової міопатії TNNT1, як правило, були найбільш уражені (Рисунок 6C). Це було особливо очевидно під час побудови графіків аналізу головних компонентів (PCA) псевдоздутих волокон для кожного пацієнта, причому пацієнти 2 та 3 з немаліновою міопатією TNNT1 виявилися найбільш віддаленими від контрольних зразків (Додатковий Рисунок 11B, Додатковий Набір Даних 20). Щоб краще зрозуміти, як волокна від пацієнтів з міопатією порівнюються зі здоровими волокнами, ми використовували детальну інформацію, отриману з протеомного аналізу 1000 волокон від здорових дорослих учасників. Ми спроектували волокна з набору даних про міопатію (пацієнти з немаліновою міопатією ACTA1 та TNNT1 та контрольна група) на графік PCA, отриманий з протеомного аналізу 1000 волокон (Рисунок 6D). Розподіл типів волокон MYH вздовж PC2 у контрольних волокнах був подібним до розподілу волокон, отриманого з протеомного аналізу 1000 волокон. Однак більшість волокон у пацієнтів з немаліновою міопатією зміщувалися вниз по PC2, перекриваючись зі здоровими швидкоскорочувальними волокнами, незалежно від їхнього природного типу волокон MYH. Таким чином, хоча пацієнти з немаліновою міопатією ACTA1 показали зсув у бік волокон 1 типу при кількісному визначенні за допомогою методів на основі MYH, як ACTA1 немалінова міопатія, так і TNNT1 немалінова міопатія зміщували протеом волокон скелетних м'язів у бік швидкоскорочувальних волокон.
Потім ми безпосередньо порівняли кожну групу пацієнтів зі здоровими контрольними групами та ідентифікували 256 та 552 диференційно експресовані білки при немалінових міопатіях ACTA1 та TNNT1 відповідно (Рисунок 6E–G та Додатковий Рисунок 11C, Додатковий Набір Даних 21). Аналіз збагачення генів виявив скоординоване зниження мітохондріальних білків (Рисунок 6H–I, Додатковий Набір Даних 22). Дивно, але, незважаючи на диференціальне переважання типів волокон при немалінових міопатіях ACTA1 та TNNT1, це зниження було повністю незалежним від типу волокон на основі MYH (Рисунок 6H та Додаткові Рисунки 11D–I, Додатковий Набір Даних 23). Три мікробні білки також регулювалися при немалінових міопатіях ACTA1 або TNNT1. Два з цих мікропротеїнів, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (також відомий як LINC00598 або Lnc-FOXO1) та ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), показали різну кількість лише в міофібрах типу 1. Раніше повідомлялося, що ENSG00000215483_TR14_ORF67 відіграє певну роль у регуляції клітинного циклу.56 З іншого боку, рівень ENSG00000232046_TR1_ORF437 (що відповідає LINC01798) був підвищений у міофібрах як типу 1, так і типу 2A при ACTA1-немаліновій міопатії порівняно зі здоровими людьми контрольної групи (Додатковий рисунок 12A, Додатковий набір даних 24). На противагу цьому, рибосомні білки значною мірою не зазнали впливу немалінової міопатії, хоча RPS17 був знижений при немаліновій міопатії ACTA1 (рис. 6E).
Аналіз збагачення також виявив підвищену регуляцію процесів імунної системи при немалінових міопатіях ACTA1 та TNNT1, тоді як клітинна адгезія також була збільшена при TNNT1 немаліновій міопатії (Рисунок 6H). Збагачення цих позаклітинних факторів відображалося на зміщенні позаклітинних матриксних білків PCA в PC1 та PC2 у негативному напрямку (тобто до найбільш уражених волокон) (Рисунок 6J). Обидві групи пацієнтів показали підвищену експресію позаклітинних білків, що беруть участь в імунних відповідях та механізмах репарації сарколеми, таких як анексини (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 та взаємодіючий з ними білок S100A1159 (Додаткові рисунки 12B–C). Раніше повідомлялося, що цей процес посилюється при м'язових дистрофіях60, але, наскільки нам відомо, раніше не був пов'язаний з немаліновими міопатіями. Нормальна функція цього молекулярного апарату необхідна для репарації сарколеми після травми та для злиття новоутворених міоцитів з міофібробластами58,61. Таким чином, підвищена активність цього процесу в обох групах пацієнтів свідчить про репаративну реакцію на пошкодження, спричинене нестабільністю міофібр.
Вплив кожної немалінової міопатії добре корелював (r = 0,736) та демонстрував значне перекриття (Додаткові рисунки 11A–B), що вказує на те, що немалінова міопатія ACTA1 та TNNT1 має подібний вплив на протеом. Однак деякі білки регулювалися лише при немаліновій міопатії ACTA1 або TNNT1 (Додаткові рисунки 11A та C). Профібротичний білок MFAP4 був одним із найбільш підвищено регульованих білків при немаліновій міопатії TNNT1, але залишався незмінним при немаліновій міопатії ACTA1. SKIC8, компонент комплексу PAF1C, відповідальний за регуляцію транскрипції гена HOX, був знижено регульований при немаліновій міопатії TNNT1, але не змінювався при немаліновій міопатії ACTA1 (Додатковий рисунок 11A). Пряме порівняння немалінової міопатії ACTA1 та TNNT1 виявило більше зниження рівня мітохондріальних білків та збільшення рівня білків імунної системи при немаліновій міопатії TNNT1 (Рисунок 6G–H та Додаткові Рисунки 11C та 11H–I). Ці дані узгоджуються з більшою атрофією/дистрофією, що спостерігається при немаліновій міопатії TNNT1 порівняно з немаліновою міопатією TNNT1 (Рисунок 6A), що свідчить про те, що немалінова міопатія TNNT1 є більш важкою формою захворювання.
Щоб оцінити, чи спостерігаються ефекти немалінової міопатії на рівні всього м'яза, ми провели масовий протеомний аналіз м'язових біоптатів тієї ж когорти пацієнтів з немаліновою міопатією TNNT1 та порівняли їх з контрольною групою (n=3 на групу) (Додатковий рис. 13A, Додатковий набір даних 25). Як і очікувалося, контрольна група була тісно пов'язана в аналізі головних компонентів, тоді як пацієнти з немаліновою міопатією TNNT1 демонстрували вищу міжвибіркову варіабельність, подібну до тієї, що спостерігалася при аналізі окремих волокон (Додатковий рис. 13B). Масовий аналіз відтворив диференційно експресовані білки (Додатковий рис. 13C, Додатковий набір даних 26) та біологічні процеси (Додатковий рис. 13D, Додатковий набір даних 27), виділені шляхом порівняння окремих волокон, але втратив здатність розрізняти різні типи волокон та не врахував гетерогенні ефекти захворювання на різні волокна.
У сукупності ці дані демонструють, що протеоміка окремих міофібрил може з'ясувати клінічні біологічні особливості, які неможливо виявити за допомогою цільових методів, таких як імуноблотінг. Більше того, ці дані підкреслюють обмеження використання лише типізації актинових волокон (MYH) для опису фенотипової адаптації. Дійсно, хоча перемикання типів волокон відрізняється між актиновими та тропоніновими немаліновими міопатіями, обидві немалінові міопатії відокремлюють типізацію волокон MYH від метаболізму волокон скелетних м'язів у бік швидшого та менш окислювального м'язового протеому.
Клітинна гетерогенність є критично важливою для того, щоб тканини задовольняли свої різноманітні потреби. У скелетних м'язах це часто описується як типи волокон, що характеризуються різним ступенем вироблення сили та втомлюваності. Однак очевидно, що це пояснює лише невелику частину мінливості волокон скелетних м'язів, яка є набагато більш мінливою, складною та багатогранною, ніж вважалося раніше. Технологічний прогрес тепер пролив світло на фактори, що регулюють волокна скелетних м'язів. Дійсно, наші дані свідчать про те, що волокна типу 2X можуть не бути окремим підтипом волокон скелетних м'язів. Більше того, ми визначили метаболічні білки, рибосомні білки та клітинно-асоційовані білки як основні детермінанти гетерогенності волокон скелетних м'язів. Застосовуючи наш протеомний робочий процес до зразків пацієнтів з нематодною міопатією, ми додатково продемонстрували, що типізація волокон на основі MYH не повністю відображає гетерогенність скелетних м'язів, особливо коли система порушена. Дійсно, незалежно від типу волокон на основі MYH, нематодна міопатія призводить до зсуву в бік швидших та менш окислювальних волокон.
Класифікація волокон скелетних м'язів проводиться з 19 століття. Нещодавні омічні аналізи дозволили нам почати розуміти профілі експресії різних типів волокон MYH та їх реакції на різні подразники. Як описано тут, омічні підходи також мають перевагу більшої чутливості для кількісного визначення маркерів типу волокон, ніж традиційні методи на основі антитіл, без покладання на кількісне визначення одного (або кількох) маркерів для визначення типу волокон скелетних м'язів. Ми використовували комплементарні транскриптомні та протеомні робочі процеси та інтегрували результати для вивчення транскрипційної та посттранскрипційної регуляції гетерогенності волокон у волокнах скелетних м'язів людини. Цей робочий процес призвів до неможливості ідентифікувати чисті волокна типу 2X на рівні білка в латеральному широкому м'язі нашої когорти здорових молодих чоловіків. Це узгоджується з попередніми дослідженнями окремих волокон, які виявили <1% чистих волокон 2X у здорових латеральних широких м'язах, хоча це має бути підтверджено в інших м'язах у майбутньому. Розбіжність між виявленням майже чистих волокон 2X на рівні мРНК та лише змішаних волокон 2A/2X на рівні білка є загадковою. Експресія мРНК ізоформи MYH не є циркадною,67 що свідчить про те, що ми навряд чи «пропустили» сигнал початку MYH2 у, здавалося б, чистих 2X волокнах на рівні РНК. Одним з можливих пояснень, хоча й суто гіпотетичним, можуть бути відмінності в стабільності білка та/або мРНК між ізоформами MYH. Дійсно, жодне швидке волокно не є на 100% чистим для будь-якої ізоформи MYH, і неясно, чи рівні експресії мРНК MYH1 у діапазоні 70–90% призведуть до однакової кількості MYH1 та MYH2 на рівні білка. Однак, розглядаючи весь транскриптом або протеом, кластерний аналіз може впевнено ідентифікувати лише два окремі кластери, що представляють повільні та швидкі волокна скелетних м'язів, незалежно від їх точного складу MYH. Це узгоджується з аналізами, що використовують одноядерні транскриптомні підходи, які зазвичай ідентифікують лише два окремі міонуклеарні кластери. 68, 69, 70 Крім того, хоча попередні протеомні дослідження ідентифікували волокна типу 2X, ці волокна не кластеризуються окремо від решти швидких волокон і демонструють лише невелику кількість диференційно поширених білків порівняно з іншими типами волокон на основі MYH.14 Ці результати свідчать про те, що нам слід повернутися до погляду на класифікацію м'язових волокон початку 20-го століття, який поділяв волокна скелетних м'язів людини не на три окремі класи на основі MYH, а на два кластери на основі їх метаболічних та скоротливих властивостей.63
Що ще важливіше, гетерогенність міофібрил слід розглядати з кількох точок зору. Попередні дослідження «оміки» вказували на це, припускаючи, що волокна скелетних м'язів не утворюють окремих кластерів, а розташовані вздовж континууму. 11, 13, 14, 64, 71 Тут ми показуємо, що, окрім відмінностей у скоротливих та метаболічних властивостях скелетних м'язів, міофібрили можна диференціювати за ознаками, пов'язаними з міжклітинною взаємодією та механізмами трансляції. Дійсно, ми виявили гетерогенність рибосом у волокнах скелетних м'язів, яка сприяє гетерогенності незалежно від типів повільних та швидких волокон. Основна причина цієї суттєвої гетерогенності міофібрил, незалежно від типу повільних та швидких волокон, залишається неясною, але вона може вказувати на спеціалізовану просторову організацію в межах м'язових пучків, які оптимально реагують на специфічні сили та навантаження,72 спеціалізовану клітинну або органоспецифічну комунікацію з іншими типами клітин у м'язовому мікросередовищі73,74,75 або відмінності в активності рибосом в межах окремих міофібрил. Дійсно, було показано, що рибосомна гетероплазмія, або через паралогічне заміщення RPL3 та RPL3L, або на рівні 2'O-метилювання рРНК, пов'язана з гіпертрофією скелетних м'язів76,77. Мультіомічні та просторові застосування в поєднанні з функціональною характеристикою окремих міофібріл сприятимуть подальшому розумінню біології м'язів на мультиомічному рівні78.
Аналізуючи протеоми окремих міофіброк у пацієнтів з немаліновими міопатіями, ми також продемонстрували корисність, ефективність та застосовність протеоміки окремих міофіброк для з'ясування клінічної патофізіології скелетних м'язів. Більше того, порівнюючи наш робочий процес з глобальним протеомним аналізом, ми змогли продемонструвати, що протеоміка окремих міофіброк дає таку ж глибину інформації, як і глобальна тканинна протеоміка, і розширює цю глибину, враховуючи міжволокнисту гетерогенність та тип міофіброк. На додаток до очікуваних (хоч і змінних) відмінностей у співвідношенні типів волокон, що спостерігаються при немалінових міопатіях ACTA1 та TNNT1 порівняно зі здоровими людьми контрольної групи,19 ми також спостерігали окисне та позаклітинне ремоделювання незалежно від перемикання типів волокон, опосередкованого MYH. Фіброз раніше повідомлявся при немалінових міопатіях TNNT1.19 Однак наш аналіз ґрунтується на цьому висновку, також виявляючи підвищений рівень позаклітинно секретованих стресових білків, таких як анексини, що беруть участь у механізмах репарації сарколеми, у міофібріблах пацієнтів з немаліновими міопатіями ACTA1 та TNNT1.57,58,59 На завершення, підвищений рівень анексину в міофібріблах пацієнтів з немаліновою міопатією може являти собою клітинну відповідь на відновлення сильно атрофічних міофібр.
Хоча це дослідження являє собою найбільший на сьогоднішній день аналіз цілісної м'язової оміки окремих волокон у людей, воно не позбавлене обмежень. Ми виділили волокна скелетних м'язів з відносно невеликої та однорідної вибірки учасників та одного м'яза (латерального широкого м'яза плечей). Тому неможливо виключити існування специфічних популяцій волокон у різних типах м'язів та на крайніх рівнях м'язової фізіології. Наприклад, ми не можемо виключити можливість появи підмножини надшвидких волокон (наприклад, чистих 2X-волокна) у високотренованих спринтерів та/або силових спортсменів79 або в періоди м'язової бездіяльності66,80. Крім того, обмежений розмір вибірки учасників завадив нам дослідити статеві відмінності в гетерогенності волокон, оскільки відомо, що співвідношення типів волокон відрізняється у чоловіків і жінок. Крім того, ми не змогли провести транскриптомний та протеомний аналізи на тих самих м'язових волокнах або зразках від тих самих учасників. Оскільки ми та інші продовжуємо оптимізувати аналізи окремих клітин та окремих міофібрил за допомогою омічного аналізу для досягнення наднизького вхідного навантаження зразка (як продемонстровано тут, в аналізі волокон пацієнтів з мітохондріальною міопатією), стає очевидною можливість поєднання мультиомічних (та функціональних) підходів в межах окремих м'язових волокон.
Загалом, наші дані визначають та пояснюють транскрипційні та посттранскрипційні рушійні сили гетерогенності скелетних м'язів. Зокрема, ми представляємо дані, які ставлять під сумнів давню догму у фізіології скелетних м'язів, пов'язану з класичним визначенням типів волокон на основі мієломи та мієломи (MYH). Ми сподіваємося відновити дискусію та зрештою переосмислити наше розуміння класифікації та гетерогенності волокон скелетних м'язів.
Чотирнадцять учасників європеоїдної раси (12 чоловіків та 2 жінки) добровільно погодилися взяти участь у цьому дослідженні. Дослідження було схвалено Етичним комітетом Університетської лікарні Гента (BC-10237), відповідало Гельсінській декларації 2013 року та зареєстровано на ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Загальні характеристики учасників представлені в Додатковій таблиці 1. Після отримання усної та письмової інформованої згоди учасники пройшли медичний огляд перед остаточним включенням до дослідження. Учасники були молодими (22–42 роки), здоровими (без захворювань, без історії куріння) та помірно фізично активними. Максимальне споживання кисню визначалося за допомогою степ-ергометра для оцінки фізичної підготовки, як описано раніше. 81
Зразки біопсії м'язів збирали у стані спокою та натщесерце тричі з інтервалом у 14 днів. Оскільки ці зразки збирали в рамках більш масштабного дослідження, учасники вживали плацебо (лактозу), антагоніст H1-рецепторів (540 мг фексофенадину) або антагоніст H2-рецепторів (40 мг фамотидину) за 40 хвилин до біопсії. Раніше ми продемонстрували, що ці антагоністи гістамінових рецепторів не впливають на фізичну форму скелетних м'язів у стані спокою81, і на наших діаграмах контролю якості не спостерігалося кластеризації, пов'язаної зі станом (Додаткові рисунки 3 та 6). Стандартизована дієта (41,4 ккал/кг маси тіла, 5,1 г вуглеводів/кг маси тіла, 1,4 г білка/кг маси тіла та 1,6 г жиру/кг маси тіла) дотримувалася протягом 48 годин до кожного експериментального дня, а стандартизований сніданок (1,5 г вуглеводів/кг маси тіла) споживали вранці експериментального дня. Під місцевою анестезією (0,5 мл 1% лідокаїну без адреналіну) отримували біопсію м'язів латерального широкого м'яза за допомогою перкутанної аспірації Бергстрема.82 Зразки м'язів негайно заливали в RNAlater та зберігали при 4°C до ручної дисекції волокон (до 3 днів).
Свіжовиділені пучки міофібрил переносили на свіже середовище RNAlater у культуральній чашці. Окремі міофібрили потім вручну препарували за допомогою стереомікроскопа та тонкого пінцета. З кожного біопсійного уламка було вилучено двадцять п'ять волокон, приділяючи особливу увагу вибору волокон з різних ділянок біопсії. Після препарування кожне волокно обережно занурювали у 3 мкл буфера для лізису (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad), що містить ферменти протеїнази К та ДНКази, для видалення небажаних білків та ДНК. Лізис клітин та видалення білка/ДНК потім ініціювали шляхом короткочасного перемішування на вортексі, обертання рідини в мікроцентрифузі та інкубації при кімнатній температурі (10 хв). Лізат потім інкубували в термоциклері (T100, Bio-Rad) при 37°C протягом 5 хв, 75°C протягом 5 хв, а потім негайно зберігали при -80°C до подальшої обробки.
Ілюміна-сумісні поліаденільовані РНК-бібліотеки були підготовлені з 2 мкл лізату міофібр за допомогою набору QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Детальні методи можна знайти в інструкції виробника. Процес починається з синтезу кДНК першого ланцюга шляхом зворотної транскрипції, під час якого вводяться унікальні молекулярні ідентифікатори (UMI) та специфічні для зразка штрих-коди i1 для забезпечення об'єднання зразків та зменшення технічної варіабельності під час подальшої обробки. Потім кДНК з 96 міофібр об'єднується та очищається за допомогою магнітних кульок, після чого РНК видаляється та виконується синтез другого ланцюга з використанням випадкових праймерів. Бібліотеку очищають за допомогою магнітних кульок, додають специфічні для пулу мітки i5/i7 та ампліфікують за допомогою ПЛР. На заключному етапі очищення отримують бібліотеки, сумісні з Ілюміна. Якість кожного пулу бібліотек оцінювали за допомогою набору для аналізу ДНК високої чутливості малих фрагментів (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
На основі кількісного визначення кубітів пули додатково об'єднували в еквімолярних концентраціях (2 нМ). Отриманий пул потім секвенували на приладі NovaSeq 6000 у стандартному режимі з використанням набору реагентів NovaSeq S2 (1 × 100 нуклеотидів) із завантаженням 2 нМ (4% PhiX).
Наш конвеєр базується на конвеєрі аналізу даних QuantSeq Pool від Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Дані спочатку були демультиплексовані за допомогою bcl2fastq2 (v2.20.0) на основі індексу i7/i5. Потім зчитування 2 було демультиплексовано за допомогою idemux (v0.1.6) на основі штрих-коду зразка i1, а послідовності UMI були вилучені за допомогою umi_tools (v1.0.1). Потім зчитування були обрізані за допомогою cutadapt (v3.4) у кількох раундах, щоб видалити короткі зчитування (довжиною <20) або зчитування, що складаються виключно з адаптерних послідовностей. Потім зчитування були вирівняні з геномом людини за допомогою STAR (v2.6.0c), а файли BAM були індексовані за допомогою SAMtools (v1.11). Дублікати зчитувань були видалені за допомогою umi_tools (v1.0.1). Нарешті, підрахунок вирівнювання було виконано за допомогою featureCounts у Subread (v2.0.3). Контроль якості проводився за допомогою FastQC (v0.11.9) на кількох проміжних етапах конвеєра.
Вся подальша біоінформаційна обробка та візуалізація виконувалася в R (версія 4.2.3), переважно з використанням робочого процесу Seurat (версія 4.4.0).83 Таким чином, окремі значення UMI та матриці метаданих були перетворені на об'єкти Seurat. Гени, що експресуються менш ніж у 30% усіх волокон, були видалені. Зразки низької якості були видалені на основі мінімального порогу в 1000 значень UMI та 1000 виявлених генів. Зрештою, 925 волокон пройшли всі етапи фільтрації контролю якості. Значення UMI були нормалізовані за допомогою методу Seurat SCTransform версії 2,84 включаючи всі 7418 виявлених ознак, а відмінності між учасниками були регресовані. Всі відповідні метадані можна знайти в Додатковому наборі даних 28.
Час публікації: 10 вересня 2025 р.