Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, який ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращих результатів ми рекомендуємо використовувати нову версію свого браузера (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображаємо сайт без стилізації або JavaScript.
Зростання мікробів у ранах часто виявляється як біоплівки, які заважають загоєнню і важко викорінювати. Нові срібні заправки стверджують, що боротьба з інфекціями ран, але їх ефективність антибіофілми та незалежні від інфекції цілющі ефекти, як правило, невідомі. Використовуючи моделі біоплівки in vitro та in vivo Staphylococcus aureus та Pseudomonas aeruginosa, ми повідомляємо про ефективність вкладених іонів Ag1+; Ag1+ заправки, що містять етилендіамінеттраоцтова кислота та хлорид бензетонію (Ag1+/EDTA/BC), та заправки, що містять нітрату срібла (Ag Oxysalts). , які виробляють іони AG1+, AG2+ та AG3+ для боротьби з біоплівкою рани та її впливу на загоєння. Зв'язки AG1+ мали мінімальний вплив на біоплівку рани in vitro та у мишей (C57BL/6J). Навпаки, кисневі солі Ag та Ag1+/EDTA/BC заправки значно зменшили кількість життєздатних бактерій у біоплівках in vitro та продемонстрували значне зниження бактеріальних та EPS компонентів у біофілмах рани миші. Ці заправки мали різний вплив на загоєння ран, інфікованих біоплівкою та не-біофілмі, інфіковані кисневими соляними заправками, що мають більш сприятливий вплив на реепітеліалізацію, розмір рани та запалення порівняно з контрольними обробками та іншими срібними заправками. Різні фізико-хімічні властивості срібних заправ можуть мати різний вплив на біоплівку рани та загоєння, і це слід враховувати при виборі заправки для лікування ран, інфікованих біоплівкою.
Хронічні рани визначаються як "рани, які не проходять на нормальні стадії зцілення впорядковано і своєчасно" 1. Хронічні рани створюють психологічний, соціальний та економічний тягар для пацієнтів та системи охорони здоров'я. Щорічні витрати NHS на обробку ран та супутніх супутніх захворювань оцінюються в 8,3 мільярда фунтів у 2017–182 роках. В даний час хронічні рани також є актуальною проблемою в США, при цьому Medicare оцінює щорічну вартість лікування пацієнтів з ранами на рівні 28,1–96,8 мільярда доларів.
Інфекція є головним фактором, що запобігає загоєнню ран. Інфекції часто проявляються як біоплівки, які присутні у 78% нецілювальних хронічних ран. Біоплівки утворюються, коли мікроорганізми стають незворотно прикріпленими до поверхонь, таких як поверхні рани, і можуть агрегати, утворюючи спільноти позаклітинного полімеру (EPS). Біоплівка рани пов'язана зі збільшенням запальної реакції, що призводить до пошкодження тканин, що може затримати або запобігти загоєнню4. Збільшення пошкодження тканин може частково пояснюватися посиленням активності матричних металопротеїназ, колагенази, еластази та реактивних видів кисню5. Більше того, запальні клітини та біоплівки самі по собі є високими споживачами кисню і, отже, можуть спричинити локальну гіпоксію тканин, виснажливі клітини життєво важливого кисню, необхідного для ефективного відновлення тканин6.
Зрілі біоплівки високо стійкі до антимікробних засобів, що потребують агресивних стратегій для боротьби з інфекціями біоплівки, таких як механічне лікування з подальшим ефективним антимікробним лікуванням. Оскільки біоплівки можуть швидко регенеруватися, ефективні антимікробні препарати можуть знизити ризик переробки після хірургічного дебриментації7.
Срібло все частіше використовується в антимікробних заправках і часто використовується як лікування першої лінії для хронічних заражених ран. Існує безліч комерційно доступних срібних ремінців, кожна з яких містить різну срібну композицію, концентрацію та базову матрицю. Успіхи срібних пов'язок призвели до розробки нових пов'язок із сріблом. Металева форма срібла (Ag0) інертна; Для досягнення антимікробної ефективності він повинен втратити електрон, утворюючи іонне срібло (Ag1+). Традиційні срібні заправки містять срібні сполуки або металеве срібло, яке при вплиді рідині розкладається на утворення іонів Ag1+. Ці іони Ag1+ реагують з бактеріальною клітиною, видаляючи електрони з структурних компонентів або критичних процесів, необхідних для виживання. Запатентована технологія призвела до розробки нової срібної сполуки, Ag Oxysalts (срібна нітрат, Ag7NO11), яка входить у заправки рани. На відміну від традиційного срібла, розкладання солей, що містять киснем, виробляє стани срібла з більшою валентністю (AG1+, AG2+та AG3+). Дослідження in vitro показали, що низькі концентрації кисневих солей срібла є більш ефективними, ніж одиночне іонне срібло (Ag1+) проти патогенних бактерій, таких як Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus та Escherichia coli8,9. Ще один новий тип срібної заправки включає додаткові інгредієнти, а саме етилендіамінетрацоцтова кислота (EDTA) та хлорид бензетонію (BC), які, як повідомляється, націлюють на біоплівку EPS і тим самим збільшують проникнення срібла в біоплівку. Ці нові срібні технології пропонують нові способи націлювання на біоплівки рани. Однак вплив цих антимікробних препаратів на середовище рани та незалежне від інфекції є важливим для того, щоб вони не створювали несприятливе середовище рани або затримка загоєння. Повідомлялося про занепокоєння щодо цитотоксичності срібла in vitro з декількома срібними обв'язками10,11. Однак цитотоксичність in vitro ще не перетворилася на токсичність in vivo, і кілька заправок Ag1+ продемонстрували хороший профіль безпеки12.
Тут ми дослідили ефективність карбоксиметилцелюлозних заправ, що містять нові срібні рецептури проти біоплівки рани in vitro та in vivo. Крім того, оцінювали вплив цих перев’язків на імунні реакції та цілющі незалежні від зараження.
Усі використані заправки були комерційно доступні. 3 м заправка з гелевого волокна Kerracel (3M, Knutsford, Великобританія)-це неантимікробна 100% карбоксиметилцелюлозна (CMC) гелева волокна, яка використовувалася в якості контрольної заправки в цьому дослідженні. Було оцінено три антимікробні срібні заправки CMC, а саме 3 м. Переправа Kerracel AG (3 м, Knutsford, Великобританія), яка містить 1,7 мас.%. киснева сіль (Ag7NO11) у більш високих іонах срібла (Ag1+, Ag2+та Ag3+). Під час розкладання іонів AG7NO11, AG1+, AG2+ та AG3+ утворюються у співвідношенні 1: 2: 4. Aquacel AG додаткова перев'язка, що містить 1,2% хлориду срібла (AG1+) (Convatec, Deeside, Великобританія) 13 та аквакель AG+додаткова перев'язка, що містить 1,2% хлориду срібла (AG1+), EDTA та хлориду бензетонію (Convatec, Deeside, Великобританія) 14.
Штам, які використовувались у цьому дослідженні, були Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) та Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Бактерії вирощували протягом ночі в бульйоні Мюллер-Хінтон (Oxoid, Altrincham, Великобританія). Потім культуру протягом ночі розбавляли 1: 100 у бульйоні Мюллера-Хінтона і 200 мкл покрили на стерильні мембрани на 0,2 мкм Whatman Cyclopore (Whatman Plc, Maidstone, Великобританія) на агарні пластини Мюллера-Гінтона (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Великобританія .). ) Формування колоніальної біоплівки при 37 ° С протягом 24 годин. Ці колоніальні біоплівки тестували на логарифмічну усадку.
Наріжте заправку на 3 см2 квадратних шматочків і попередньо моустен стерильною деіонізованою водою. Покладіть пов’язку над біоплівкою колонії на пластині ага. Кожні 24 га біоплівки видаляли, а життєздатні бактерії всередині біоплівки (CFU/мл) кількісно визначали за допомогою серійного розведення (від 10–1 до 10−7) у бульйоні нейтралізації денного кута (Merck-Millipore). Після 24 годин інкубації при 37 ° С стандартний кількість пластини проводили на пластинах агару Мюллера-Гінтона. Кожну обробку та часовий момент проводили в трьох примірниках, а кількість пластини повторювалася для кожного розведення.
Шкіра свинячого живота отримується від жінок великих білих свиней протягом 15 хвилин після забою відповідно до стандартів експорту Європейського Союзу. Шкіру поголили і очищали спиртними серветками, потім заморожували при -80 ° С протягом 24 годин, щоб відхилити шкіру. Після відтавання 1 см2 шматочків шкіри тричі промивали PBS, 0,6% гіпохлориту натрію та 70% етанолу протягом 20 хвилин щоразу. Перед тим, як видалити епідерміс, видаліть будь -який решту етанолу, промивши 3 рази в стерильні PBS. Шкіру культивували в 6-лунчій пластині з нейлоновою мембраною товщиною 0,45 мкм (Merck-міліпором) зверху та 3 поглинальними прокладками (Merck-міліпором), що містять 3 мл сироватки великої рогатої худоби (Sigma), доповнений модифікованою 10% Dulbecco's Modified Орел. Середній (модифікований орел -середовище Dulbecco - ТОВ «Олдріх»).
Колоніальні біоплівки вирощували, як описано для досліджень впливу біоплівки. Після культивування біоплівки на мембрані протягом 72 годин біоплівку наносили на поверхню шкіри за допомогою стерильної петлі щеплення і мембрану видаляли. Потім біоплівку інкубували на дермі свині протягом додаткових 24 годин при 37 ° С, що дозволить біоплівці дозріти і прилипати до шкіри свині. Після того, як біоплівка дозріла і прикріплена, заправка 1,5 см2, попередньо моновитана стерильною дистильованою водою, наносили безпосередньо на поверхню шкіри та інкубували при 37 ° С протягом 24 годин. Життєздатні бактерії візуалізували шляхом фарбування за рахунок рівномірного застосування реагенту життєздатності клітин Prestoblue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Великобританія) на апікальну поверхню кожного пояснювача та інкубуючи його протягом 5 хвилин. Використовуйте цифрову камеру Leica DFC425, щоб миттєво зняти зображення на мікроскопі Leica MZ8. Області кольорові рожеві були кількісно визначені за допомогою програмного забезпечення Image Pro версії 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (Mediacy.com)). Скануючу електронну мікроскопію проводили, як описано нижче.
Бактерії, вирощені протягом ночі, розбавляли 1: 100 у бульйоні Мюллера-Хінтона. 200 мкл культури додавали до стерильної мембрани циклопору Whatman Whatman (Whatman, Maidstone, Великобританія) і покладали на агар Мюллера-Хінтона. Пластинки біоплівки інкубували при 37 ° С протягом 72 годин, щоб забезпечити утворення зрілої біоплівки.
Після 3 днів дозрівання біоплівки 3 см2 квадратної пов’язки розміщували безпосередньо на біоплівку та інкубували при 37 ° С протягом 24 годин. Після видалення пов’язки з поверхні біоплівки 1 мл реагенту життєздатності клітин Prestoblue (Invitrogen, Waltham, MA) додавали на поверхню кожної біоплівки протягом 20 секунд. Поверхні сушили до того, як зміни кольору були записані за допомогою цифрової камери Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Кінгстон, Великобританія).
Підготуйте культури на ніч на агару Мюллера-Хінтона, передайте окремі колонії на 10 мл бульйону Мюллера-Хінтона та інкубуйте на шейкер при 37 ° С (100 об / хв). Після інкубації протягом ночі культуру розбавляли 1: 100 у бульйоні Мюллера-Гінтона, а 300 мкл був помічений на 0,2 мкм циркулярну циклору (Whatman International, Maidstone, Великобританія) на агарі Мюллера-Гінтона та інкубували при 37 ° С протягом 72 годин . . Зрілу біоплівку застосовували до рани, як описано нижче.
Вся робота з тваринами проводилася в Манчестерському університеті за ліцензією проекту, затвердженою Управлінням захисту тварин та етичним оглядом (P8721BD27) та відповідно до вказівок, опублікованих Міністерством внутрішніх справ відповідно до переглянутої ASPA 2012 року. Усі автори дотримувались рекомендацій щодо прибуття. Весь тижневі миші C57BL/6J (EnviGo, Oxon, Великобританія) використовувались для всіх досліджень in vivo. Мишам анестезували ізофлураном (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Великобританія), а їх спинні поверхні були поголені та очищені. Потім кожній миші отримували виражаюче рани 2 × 6 мм за допомогою удару стайні -біопсії (Schuco International, Hertfordshire, Великобританія). Для ран, інфікованих біоплівкою, нанесіть 72-годинну колоніальну біоплівку, вирощену на мембрані, як описано вище, до шкірного шару рани, використовуючи стерильну петлю щеплення відразу після травми та відкиньте мембрану. Один квадратний сантиметр заправки заздалегідь переміщується стерильною водою, щоб підтримувати вологе середовище рани. Зв'язки наносили безпосередньо на кожну рану і покривали 3 -метровою плівкою Tegaderm (3M, Bracknell, Великобританія) та рідким клеєм мастизолом (Heaquest Healthcare, Ferndale, MI), нанесених по краях, щоб забезпечити додаткову адгезію. Бупренорфін (Animalcare, Йорк, Великобританія) вводили в концентрації 0,1 мг/кг як знеболюючий засіб. Кулл -миші через три дні після травми за допомогою методу графіку 1 та видаліть, вдвічі та зберігайте область рани за потребою.
Гематоксилін (Thermofisher Scientific) та еозин (науково -наукове) проводили відповідно до протоколу виробника. Площа рани та репітеліалізація були кількісно визначені за допомогою програмного забезпечення Image Pro версії 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Тканинні ділянки знецінювались у ксилові (Thermofisher Scientific, Loughborough, Великобританія), регідратували 100–50% градуйований етанол і ненадовго занурювали у деіонізовану воду (Thermofisher Scientific). Імуногістохімію проводили за допомогою набору Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, Каліфорнія) згідно з протоколом виробника. Первинні антитіла до нейтрофілів NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) та Macrophages MS CD107B Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Великобританія) були розведені 1: 100 у блокуючому розчині і додали до вирізаної поверхні з подальшим антитілами антитіла, векастін ABC та Vector Nova Red Peroxidase (HRP) комплект субстрату (Vector Laboratories, Burlingame, CA) та протиставляв гематоксилін. Зображення були придбані за допомогою мікроскопа Olympus BX43 та цифрової камери Olympus DP73 (Olympus, Southend-On-Sea, Великобританія).
Зразки шкіри фіксували в 2,5% глутаральдегіду та 4% формальдегіду в 0,1 М гепесу (pH 7,4) протягом 24 годин при 4 ° С. Зразки зневоднювали за допомогою градуйованого етанолу та висушували в СО2 за допомогою сушарки критичної точки Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Великобританія) та розпиленням, покритого золотим сплавом, за допомогою системи розряду кворуму SC7620. Зразки зображували за допомогою скануючого електронного мікроскопа Fei Quanta 250 (Thermofisher Scientific) для візуалізації центральної точки рани.
Йодид TOTO-1 (2 мкМ) наносили на висічену поверхню рани миші та інкубували протягом 5 хв при 37 ° С (Thermofisher Scientific) і обробляли SYTO-60 (10 мкм) при 37 ° С (Thermofisher Scientific). 15-хвилинні зображення Z-Stack були створені за допомогою Leica TCS SP8.
Біологічні та технічні повторювані дані були таблиці та проаналізовані за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, Каліфорнія). Односторонній аналіз дисперсії з множинними порівняннями з використанням пост-спеціального тесту Даннета був використаний для тестування на відмінності між кожним лікуванням та не антимікробним контролем. Значення P <0,05 вважалося значним.
Ефективність срібних гелевих фіброзних перев’язків вперше оцінювались проти колоній біоплівки стафілокока аурея та Pseudomonas aeruginosa in vitro. Срібні заправки містять різні формули срібла: Традиційні срібні заправки виробляють іони Ag1+; Срібні заправки, які можуть виробляти іони Ag1+ після додавання EDTA/BC, можуть знищити матрицю біоплівки та піддавати бактерії сріблом під антибактеріальним ефектом срібла. Іони15 та заправки, що містять кисневі солі АГ, які виробляють іони AG1+, AG2+ та AG3+. Його ефективність порівнювали з неантимікробним контролем, виготовленим з гелерованих волокон. Залишилися життєздатні бактерії в біоплівці оцінювали кожні 24 години протягом 8 днів (рис. 1). На 5 день біоплівку реінокулювали 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus або 1,22 × 105p. Aeruginosa для оцінки відновлення біоплівки. Порівняно з неантимікробними контрольними заправками, заправки AG1+ мали мінімальний вплив на життєздатність бактерій у стафілокок-аурея та біоплівки Pseudomonas aeruginosa протягом 5 днів. На відміну від цього, одяки, що містять кисневі солі AG та AG1 + + EDTA/BC, були ефективними для вбивства бактерій у біоплівці протягом 5 днів. Після повторної щеплення планктонними бактеріями на 5 день не спостерігалося відновлення біоплівки (рис. 1).
Кількісне визначення життєздатних бактерій у стафілокока aureus та біоплівки Pseudomonas aeruginosa після лікування срібними заправками. Колонії біоплівки Staphylococcus aureus та Pseudomonas aeruginosa обробляли срібними заправками або не антимікробними заправками, і кількість життєздатних бактерій, що залишилися, визначали кожні 24 години. Через 5 днів біоплівку реінокулювали 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus або 1,22 × 105p. Колонії бактеріопланктону Pseudomonas aeruginosa утворювались індивідуально для оцінки відновлення біоплівки. Графіки показують середнє значення +/- стандартна помилка.
Для візуалізації впливу срібних перев’язків на життєздатність біоплівки наносили перев'язки для зрілих біоплівки, вирощених на свинячу шкіру ex vivo. Через 24 години заправка видаляється, а біоплівка фарбується синім реактивним барвником, який метаболізується живими бактеріями до рожевого кольору. Біоплівки, оброблені контрольними заправками, були рожевими, що свідчить про наявність життєздатних бактерій всередині біоплівки (мал. 2А). На відміну від цього, біоплівка, оброблена заправкою Ag Oxysols, була в першу чергу синьою, що вказує на те, що решта бактерій на поверхні шкіри свині були нежиттєздатними бактеріями (мал. 2В). Змішане блакитне та рожеве забарвлення спостерігалося в біоплівках, оброблених вбраннями, що містять Ag1+, що вказує на наявність життєздатних та нежиттєздатних бактерій всередині біоплівки (мал. 2С), тоді як EDTA/BC, що містять Ag1+, були переважно синіми з деякими рожевими плямами. вказівка на срібні області (мал. 2d). Кількісне визначення активних (рожевих) та неактивних (синіх) областей показало, що контрольний патч був 75% активним (мал. 2е). Зв'язки AG1 + + EDTA/BC виконувались аналогічно кисневим соляним заправками AG, зі швидкістю виживання 13% та 14% відповідно. Заправка Ag1+ також знижувала життєздатність бактерій на 21%. Потім ці біоплівки спостерігали за допомогою скануючої електронної мікроскопії (SEM). Після обробки контрольною заправкою та заправкою Ag1+ спостерігалося шар Pseudomonas aeruginosa, що покриває шкіру свиней (мал. 2F, Н), тоді як після лікування заправкою Ag1+ було виявлено небагато бактеріальних клітин і мало бактеріальних клітин під ним. Колагенові волокна можуть розглядатися як тканинна структура шкіри свиней (мал. 2 г). Після лікування за допомогою Ag1 + + EDTA/BC, бактеріальні бляшки та основні бляшки з колагенових волокон були видимими (мал. 2I).
Візуалізація біоплівки Pseudomonas aeruginosa після обробки срібла. (A-D) Бактеріальна життєздатність у біоплівках Pseudomonas aeruginosa, вирощених на свинячій шкірі, візуалізували за допомогою барвника життєздатності Prestoblue через 24 години після лікування за допомогою срібних заправок або не антимікробних контрольних заправок. Живі бактерії рожеві, нежиттєздатні бактерії та свиняча шкіра сині. (E) Кількісне визначення біоплівки Pseudomonas aeruginosa, вирощених на свинячій шкірі (рожева пляма), використовуючи скануючу електронну мікроскопію Image Pro версії 10 (FI) та обробляється срібною заправкою або не антимікробною заправкою для контролю протягом 24 годин. Шкала SEM = 5 мкм. (J - M) Колоніальні біоплівки виросли на фільтрах і були фарбували реактивним барвником Prestoblue через 24 години інкубації із срібними заправками.
Щоб визначити, чи впливає тісний контакт між заправками та біоплівками на ефективність перев'язків, колоніальні біоплівки, розміщені на плоскій поверхні, обробляли заправками протягом 24 годин, а потім фарбували реактивними барвниками. Нелікована біоплівка була темно -рожевим кольором (мал. 2J). На відміну від біоплівки, оброблених вбраннями, що містять кисневі солі AG (мал. 2К), біоплівки, оброблені вбраннями, що містять Ag1+ або Ag1++ EDTA/BC, показали смуги рожевого фарбування (мал. 2л, м). Це рожеве забарвлення вказує на наявність життєздатних бактерій і пов'язане з областю шва всередині заправки. Ці пришиті ділянки створюють мертві простори, які дозволяють бактерій у біоплівці вижити.
Для оцінки ефективності срібних перев’язків in vivo, повна товщина висікали рани мишей, заражені зрілими S. aureus та біоплівками P. aeruginosa, обробляли неантимікробними заправками або срібними заправками. Після 3 днів лікування макроскопічний аналіз зображень показав менші розміри ран при обробці кисневими соляними заправками порівняно з не антимікробними контрольними заправками та іншими срібними заправками (мал. 3А-Н). Для підтвердження цих спостережень рани збирали, а область рани та реепітеліалізація кількісно визначали на розділах тканин гематоксиліну та еозину, використовуючи програмне забезпечення 10 версії 10 (мал. 3i-l).
Вплив срібних перев’язків на поверхню рани та репітеліалізація ран, заражених біоплівками. (A - H) дрібні клітини, інфіковані біоплівками Pseudomonas aeruginosa (A - D) та стафілококом aureus (E - H) після трьох днів лікування неантимікробним контрольним заправкою, оксигенованою соляною заправкою Ag1+ та AG1+ заправка. Репрезентативні макроскопічні зображення. Рани мишей з заправкою Ag1 + + EDTA/BC. (IL) Репрезентативна інфекція псевдомонаса aeruginosa, гістологічні зрізи, забарвлені гематоксиліном та еозином, використовуються для кількісної оцінки площі рани та регенерації епітелію. Кількісне визначення площі ран (M, O) та відсоткова реепітеліалізація (N, P) ран, заражених Pseudomonas aeruginosa (M, N) та Staphylococcus aureus (O, P) біоплівки (на групу лікування N = 12). Графіки показують середнє значення +/- стандартна помилка. * означає p = <0,05 ** означає p = <0,01; Макроскопічна шкала = 2,5 мм, гістологічна шкала = 500 мкм.
Кількісне визначення області рани в ранах, заражених біоплівкою Pseudomonas aeruginosa (мал. 3м), показали, що рани, оброблені оксисальтами Ag, мали середній розмір рани 2,5 мм2, тоді правда. досягла статистичної значущості (мал. 3м). p = 0,423). Рани, оброблені AG1+ або AG1++ EDTA/BC, не показали зменшення площі ран (3,1 мм2 та 3,6 мм2 відповідно). Лікування кисневольованою соляною солею Ag сприяє репітеліалізації в більшій мірі, ніж неантимікробний контрольний обв'язок (34% та 15% відповідно; р = 0,029) та Ag1+ або AG1++ EDTA/BC (10% та 11%) ( Малюнок 3n). . , відповідно).
Подібні тенденції в зоні рани та регенерації епітелію спостерігалися у ран, заражених біоплівками S. aureus (мал. 3о). Обв'язки, що містять кисневі солі срібла, зменшують площу рани (2,0 мм2) на 23% порівняно з контрольним не антимікробним заправкою (2,6 мм2), хоча це зниження не було суттєвим (p = 0,304) (рис. 3о). Крім того, площа рани в групі лікування AG1+ була незначно знижена (2,4 мм2), тоді як рани, оброблену заправкою Ag1++ EDTA/BC, не зменшила площу рани (2,9 мм2). Солі кисню АГ також сприяли репітеліалізації ран, заражених біоплівкою S. aureus (31%), ніж ті, що обробляються неантимікробними контрольними заправками (12%, p = 0,003) (рис. 3p). Аг1+ одяг (16%, p = 0,903) та Ag+ 1+ EDTA/BC заправка (14%, p = 0,965) показали рівні регенерації епітелію, подібні до контролю.
Для візуалізації впливу срібних одягу на матрицю біоплівки було проведено фарбування Toto 1 та Syto 60 (рис. 4). Іодид Toto 1-це клітинно-проникливий барвник, який можна використовувати для точного візуалізації позаклітинних нуклеїнових кислот, які є рясними в ЕП біоплівки. Syto 60 - це клітинний проникний барвник, який використовується як контратаки16. Спостереження за тото 1 та йодидом SYTO 60 у ранах, прищеплених біофілмами Pseudomonas aeruginosa (мал. 4А-D) та стафілококом (мал. 4I-L), показали, що після 3 днів обробки одягання в біоплівці значно зменшено. містить кисневі солі AG та AG1 + + EDTA/BC. Зв'язки AG1+ без додаткових компонентів антибіофілму значно знижували безклітинну ДНК у ран, прищеплених Pseudomonas aeruginosa, але були менш ефективними в ранах, прищеплених стафілококом aureus.
In vivo візуалізація біоплівки рани після 3 днів лікування контрольними або срібними заправками. Конфокальні зображення Pseudomonas aeruginosa (A - D) та стафілокока aureus (I - L), забарвленого тото 1 (зеленим) для візуалізації позаклітинних нуклеїнових кислот, компонента позаклітинних полімерів біоплівки. Для фарбування внутрішньоклітинних нуклеїнових кислот використовуйте SYTO 60 (червоний). кислоти. P. Скануюча електронна мікроскопія ран, заражених Pseudomonas aeruginosa (E - H) та біоплівки Staphylococcus aureus (M - P) після 3 днів лікування контрольними та срібними заправками. Шкала SEM = 5 мкм. Шкала конфокальної візуалізації = 50 мкм.
Скануюча електронна мікроскопія показала, що миші, прищеплені біоплівкою колонії Pseudomonas aeruginosa (мал. 4е-H) та стафілококом (мал. 4м-п), мали значно менше бактерій у своїх ранах після 3 днів лікування з усіма срібними заправками.
Для оцінки впливу срібних перев’язків на запалення рани у мишей, інфікованих біоплівкою, ділянки інфікованих біоплівкою ран, оброблених контрольними або срібними заправками протягом 3 днів, імуногістохімічно забарвлювались з використанням антитіл, специфічних для нейтрофілів та макрофагів. Кількісне визначення нейтрофілів та макрофагів внутрішньо. Грануляційна тканина. Малюнок 5). Усі срібні заправки зменшили кількість нейтрофілів та макрофагів у ранах, заражених Pseudomonas aeruginosa, порівняно з не антимікробними контрольними заправками після трьох днів лікування. Однак обробка кисневою соляною сріблом призводило до більшого зниження нейтрофілів (p = <0,0001) та макрофагів (p = <0,0001) порівняно з іншими випробуваними срібними заправками (мал. 5i, j). Хоча AG1++ EDTA/BC мав більший вплив на біоплівку рани, вона знизила рівень нейтрофілів та макрофагів меншою мірою, ніж заправка Ag1+. Помірні рани, інфіковані біоплівкою S. aureus, також спостерігалися після одягання з Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) та Ag1 ++ EDTA/BC (P = 0,0043) оксизолонами порівняно з контролем. Подібні тенденції спостерігаються для нейтропенії. пов'язка (рис. 5К). Однак лише киснева сольова суть Ag показала значне зниження кількості макрофагів у грануляційній тканині порівняно з контролем ран, заражених біоплівками S. aureus (p = 0,0339) (мал. 5л).
Нейтрофіли та макрофаги кількісно визначали в ранах, заражених Pseudomonas aeruginosa та стафілококом біоплівки після 3 днів лікування неантимікробним контролем або срібними заправками. Нейтрофіли (AD) та макрофаги (EH) кількісно визначали в тканинних ділянках, забарвлених антитілами, специфічними для нейтрофілів або макрофагів. Кількісне визначення нейтрофілів (I і K) та макрофагів (J і L) у ранах, заражених Pseudomonas aeruginosa (I і J) та стафілококом aureus (K&L). N = 12 на групу. Графіки показують середнє значення +/- стандартна помилка, значення значущості порівняно з не антибактеріальним управлінням, * означає p = <0,05, ** означає p = <0,01; *** означає p = <0,001; Позначає p = <0,0001).
Потім ми оцінили вплив срібних одягів на незалежне від зараження зціленням. Неінфіковані екзізичні рани обробляли за допомогою не антимікробної контрольної заправки або срібною заправкою протягом 3 днів (мал. 6). Серед випробуваних срібних обв'язків лише рани, оброблені кисневольованою соляною одяганням, виявилися меншими на макроскопічних зображеннях, ніж рани, оброблені контролем (мал. 6А-D). Кількісне визначення області рани за допомогою гістологічного аналізу показало, що середня площа рани після лікування заправкою Ag Oxysols становила 2,35 мм2 порівняно з 2,96 мм2 для ран, оброблених контрольною групою, але ця різниця не досягла статистичної значущості (p = 0,488) (рис. . На відміну від цього, зменшення площі рани не спостерігалося після лікування Ag1+ (3,38 мм2, p = 0,757) або Ag1++ EDTA/BC (4,18 мм2, p = 0,054), порівняно з контрольною групою. Збільшена регенерація епітелію спостерігалася при перев'язці Ag Oxysol порівняно з контрольною групою (30% проти 22% відповідно), хоча це не досягло значущості (p = 0,067), це є досить значущим і підтверджує попередні результати. Заправка з оксисолами сприяє повторній епітеліалізації. -Піттелізація незаражених ран17. На відміну від цього, лікування за допомогою Ag1+ або AG1++ EDTA/BC не було ефектом або показало зменшення репеліалізації порівняно з контролем.
Вплив срібного заправки на загоєння ран у незаражених мишей з повною резекцією. (AD) Репрезентативні макроскопічні зображення ран після трьох днів лікування нетимікробним контролем та срібною заправкою. (EH) Репрезентативні зрізи рани, забарвлені гематоксиліном та еозином. Кількісне визначення області рани (I) та відсотків репітеліалізації (J) обчислювали з гістологічних секцій в середині рани за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень (n = 11–12 на групу лікування). Графіки показують середнє значення +/- стандартна помилка. * означає p = <0,05.
Срібло має довгу історію використання як антимікробну терапію при загоєнні ран, але багато різних рецептур та методів доставки можуть призвести до відмінностей в антимікробній ефективності 18. Більше того, властивості антибіофілму конкретних систем доставки срібла не повністю зрозумілі. Незважаючи на те, що імунна відповідь господаря є відносно ефективною проти планктонних бактерій, як правило, менш ефективна проти біоплівки19. Планктонні бактерії легко фагоцитозуються макрофагами, але всередині біоплівки агреговані клітини створюють додаткові проблеми, обмежуючи реакцію господаря в тій мірі, в якій імунні клітини можуть зазнавати апоптозу та вивільняти прозапальні фактори для посилення імунної відповіді20. Було помічено, що деякі лейкоцити можуть проникати в біоплівки21, але не в змозі фагоцитозно бактеріями, коли цей захист буде порушений22. Для підтримки імунної відповіді господаря проти інфекції рани біоплівки слід використовувати цілісний підхід. Розбиття рани може фізично порушити біоплівку та видалити більшу частину біобурдену, але імунна відповідь господаря може бути неефективною проти залишку біоплівки, особливо якщо імунна відповідь господаря порушена. Таким чином, антимікробні терапії, такі як срібні заправки, можуть підтримувати імунну відповідь господаря та усунути інфекції біоплівки. Склад, концентрація, розчинність та субстрат доставки можуть впливати на антимікробну ефективність срібла. Останніми роками прогрес в галузі технології обробки срібла зробило ці заправки більш ефективними 9,23. У міру просування технологій для срібла, важливо зрозуміти ефективність цих перев’язок у контролі інфекції рани та, що ще важливіше, вплив цих потужних форм срібла на рану та оздоровлення.
У цьому дослідженні ми порівнювали ефективність двох вдосконалених срібних перев'язок із звичайними срібними заправками, які виробляють іони Ag1+ проти біоплівки, використовуючи різні моделі in vitro та in vivo. Ми також оцінили вплив цих перев'язок на середовище рани та незалежне від інфекції. Щоб мінімізувати вплив матриці доставки, всі тестовані срібні обтяги складалися з карбоксиметилцелюлози.
Наша попередня оцінка цих срібних перев’язків проти колоніальних біоплівки Pseudomonas aeruginosa та стафілокока аурея показує, що на відміну від традиційних Ag1+ заправок, два вдосконалені срібні заправки, Ag1++ EDTA/BC та оксигеновані солі AG, ефективні на 5. Ефективно вбиває біофілмові бактерії в всередині кілька днів. Крім того, ці пов'язки запобігають повторному формуванню біоплівки при повторному впливі планктонних бактерій. Заправка Ag1+ містила хлорид срібла, той самий срібний сполук та базова матриця, що і AG1++ EDTA/BC, і мала обмежений вплив на життєздатність бактерій у біоплівці за той же період. Спостереження про те, що перев'язування AG1++ EDTA/BC було більш ефективним проти біоплівки, ніж заправка Ag1+, що складається з однієї матриці, і складка срібла підтримує уявлення про те, що додаткові інгредієнти необхідні для підвищення ефективності хлориду срібла проти біоплівки, як повідомлялося в іншому місці15. Ці результати підтверджують думку про те, що BC та EDTA відіграють додаткову роль, що сприяє загальній ефективності одягу, і що відсутність цього компонента в заправках Ag1+ може сприяти невдачі ефективності in vitro. Ми виявили, що кисневі солі Ag, що виробляють іони AG2+ та Ag3+, виявляли більш високу ефективність антибактерій, ніж AG1+ та на рівні, подібних до AG1++ EDTA/BC. Однак через високий окислювально -відновлюючий потенціал незрозуміло, як довго іони AG3+ залишаються активними та ефективними проти біоплівки рани, а отже, заслуговують на подальше вивчення. Крім того, існує багато різних заправок, які генерують іони Ag1+, які не були перевірені в цьому дослідженні. Ці заправки складаються з різних сполук срібла, концентрації та базових матриць, які можуть впливати на доставку іонів Ag1+ та їх ефективність проти біоплівки. Варто також зазначити, що існує багато різних моделей in vitro та in vivo, які використовуються для оцінки ефективності заправки ран проти біоплівки. Тип використовуваної моделі, а також вміст солі та білка в середовищі, що використовується в цих моделях, впливатиме на ефективність одягання. У нашій моделі in vivo ми дозволили біоплівці дозріти in vitro, а потім перенесли її на шкірну поверхню рани. Імунна відповідь миші господаря є відносно ефективною проти планктонних бактерій, застосованих до рани, тим самим утворюючи біоплівку під час заживання рани. Додавання зрілої біоплівки до рани обмежує ефективність імунної відповіді господаря на утворення біоплівки, дозволяючи зрілому біоплівці встановити себе в рані, перш ніж розпочатись. Таким чином, наша модель дозволяє нам оцінити ефективність антимікробних заправок на зрілі біоплівки до того, як рани почнуть вилікувати.
Ми також виявили, що вміст, що підходить, впливає на ефективність срібних заправ на біоплівках та шкірі свиней. Тісний контакт з раною вважається критичним для антимікробної ефективності заправки24,25. Зв'язки, що містять кисневі солі АГ, були тісними контактами зі зрілими біоплівками, що призвело до значного зменшення кількості життєздатних бактерій у біоплівці через 24 години. Навпаки, при обробці заправками AG1+ та AG1++ EDTA/BC залишається значна кількість життєздатних бактерій. Ці заправки містять шви по всій довжині заправки, що створює мертві простори, які запобігають тісному контакту з біоплівкою. У наших дослідженнях in vitro ці неконтактні ділянки запобігали вбивству життєздатних бактерій у біоплівці. Ми оцінювали життєздатність бактерій лише після 24 годин лікування; З часом, коли заправка стає більш насиченою, може бути менше мертвого простору, зменшуючи ділянку для цих життєздатних бактерій. Однак це підкреслює важливість композиції заправки, а не лише типу срібла в заправці.
Незважаючи на те, що дослідження in vitro корисні для порівняння ефективності різних технологій срібла, також важливо зрозуміти вплив цих перев’язків на біоплівки in vivo, де тканина господаря та імунні реакції сприяють ефективності перев'язок проти біоплівки. Вплив цих перев’язків на біоплівки рани спостерігався за допомогою скануючої електронної мікроскопії та фарбування EPS біоплівки з використанням внутрішньоклітинних та позаклітинних барвників ДНК. Ми виявили, що після 3 днів лікування всі заправки були ефективними для зменшення безклітинної ДНК у ран, інфікованих біоплівкою, але заправка Ag1+ була менш ефективною у ран, інфікованих стафілококом. Скануюча електронна мікроскопія також показала, що значно менше бактерій були присутні в ранах, оброблених срібними заправками, хоча це було більш виражене з кисневою соляною заправкою Ag та заправкою Ag1++ EDTA/BC порівняно з заправкою Ag1+. Ці дані показують, що випробувані срібні заправки мали різний ступінь впливу на структуру біоплівки, але жодне із срібних заправок не зміг викорінити біоплівку, підтверджуючи необхідність цілісного підходу до лікування інфекцій біоплівки рани; Використання срібних пов'язок. Лікування передує фізичному дебрибритації для видалення більшої частини біоплівки.
Хронічні рани часто знаходяться в стані важкого запалення, при цьому надлишки запальних клітин залишаються в тканині рани протягом тривалого періоду часу, спричиняючи пошкодження тканин та виснаження кисню, необхідного для ефективного клітинного метаболізму та функціонують у рани26. Біоплівки посилюють це ворожне середовище рани, негативно впливаючи на загоєння різними способами, включаючи інгібування проліферації клітин та міграції та активації прозапальних цитокінів27. Оскільки срібні заправки стають більш ефективними, важливо зрозуміти вплив, який вони мають на середовище рани та зцілення.
Цікаво, що хоча всі срібні заправки вплинули на склад біоплівки, лише кисневі солі срібла збільшували репеліалізацію цих заражених ран. Ці дані підтримують наші попередні висновки17 та дані Kalan et al. (2017) 28, який продемонстрував хороші профілі безпеки та токсичності кисневих солей срібла, оскільки менші концентрації срібла були ефективними проти біоплівки.
Наше поточне дослідження підкреслює відмінності в технології срібла між антимікробними заправками срібла та впливом цієї технології на рану та незалежне від зараження. Однак ці результати відрізняються від попередніх досліджень, що показують, що перев'язування AG1 + + EDTA/BC покращує параметри загоєння травмованих кролячих вух in vivo. Однак це може бути пов'язано з відмінностями в моделях тварин, часу вимірювання та методів застосування бактерій29. У цьому випадку вимірювання рани були проведені через 12 днів після травми, щоб дозволити активним інгредієнтам заправки діяти на біоплівку протягом більш тривалого періоду часу. Це підтверджується дослідженням, яке показало, що клінічно заражені виразки ніг, оброблені AG1 + + EDTA/BC, спочатку збільшувались у розмірі після одного тижня лікування, а потім протягом наступних 3 тижнів лікування AG1 + + EDTA/BC протягом 4 тижнів після Використання нетимікробних препаратів. наркотики. Зв'язки CMC, щоб зменшити розмір виразки30.
Показано, що певні форми та концентрації срібла є цитотоксичними in vitro 11, але ці результати in vitro не завжди перетворюються на несприятливі ефекти in vivo. Крім того, прогрес у галузі срібних технологій та краще розуміння срібних сполук та концентрацій у заправках призвели до розвитку багатьох безпечних та ефективних срібних заправок. Однак, у міру просування технологій срібного одягання, важливо зрозуміти вплив цих перев'язок на рану середовище 31,32,33. Раніше повідомлялося, що підвищена швидкість репітеліалізації відповідає збільшенню частки протизапальних макрофагів М2 порівняно з прозапальним фенотипом М1. Це було відмічено в попередній моделі миші, де заправки на гідрогелі срібла порівнювали з сульфадіазином срібла та не антимікробними гідрогелями34.
Хронічні рани можуть виявляти надмірне запалення, і було помічено, що наявність надлишків нейтрофілів може бути згубним для загоєння ран35. У дослідженні у мишей, збіднених нейтрофілами, наявність нейтрофілів затримала реепітеліалізацію. Наявність надлишків нейтрофілів призводить до високого рівня протеаз та реактивних видів кисню, таких як супероксид та перекис водню, які пов'язані з хронічними та повільними ранами37,38. Так само збільшення кількості макрофагів, якщо неконтрольоване, може призвести до затримки загоєння ран39. Це збільшення є особливо важливим, якщо макрофаги не в змозі переходити від прозапального фенотипу до фенотипу провоку, що призводить до того, що рани не змогли вийти з запальної фази загоєння40. Ми спостерігали зниження нейтрофілів та макрофагів у ран інфікованих біоплівкою після 3 днів лікування всіма срібними заправками, але зниження було більш виражене з кисневими солями. Це зменшення може бути прямим результатом імунної відповіді на срібло, реакцію на зниження біобурдена або рани, що знаходиться на пізнішій стадії загоєння, і тому імунні клітини в рані зменшуються. Зменшення кількості запальних клітин у рани може підтримувати середовище, сприятливе для загоєння ран. Механізм дії того, як АГ оксисальти сприяютьці, незалежному від інфекції, є незрозумілим, але здатність Ag оксисальти виробляти кисень та знищувати шкідливий рівень перекису водню, посередника запалення, може пояснити це і вимагає подальшого дослідження17.
Хронічні інфіковані рани, що не готуються, створюють проблему як для лікарів, так і для пацієнтів. Хоча багато заправок претендують на антимікробну ефективність, дослідження рідко зосереджуються на інших ключових факторах, що впливають на мікросередовище рани. Це дослідження показує, що різні технології срібла мають різну антимікробну ефективність і, що важливо, різний вплив на середовище рани та загоєння, незалежне від інфекції. Хоча ці дослідження in vitro та in vivo показують ефективність цих перев'язок у лікуванні інфекцій ран та сприяння загоєнню, для оцінки ефективності цих перев'язок у клініці потрібні рандомізовані контрольовані випробування.
Набори даних, що використовуються та/або проаналізовані під час поточного дослідження, доступні у відповідного автора за розумним запитом.
Час посади: 15-2024 рр.