Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращих результатів рекомендуємо використовувати новішу версію браузера (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображаємо сайт без стилізації та JavaScript.
Ріст мікробів у ранах часто проявляється у вигляді біоплівок, які перешкоджають загоєнню та їх важко викорінити. Нові срібні пов'язки обіцяють боротьбу з рановими інфекціями, але їхня ефективність у боротьбі з біоплівкою та незалежний від інфекції загоювальний ефект загалом невідомі. Використовуючи моделі біоплівки Staphylococcus aureus та Pseudomonas aeruginosa in vitro та in vivo, ми повідомляємо про ефективність пов'язок, що генерують іони Ag1+; пов'язок Ag1+, що містять етилендіамінтетраоцтову кислоту та бензетоній хлорид (Ag1+/EDTA/BC), та пов'язок, що містять нітрат срібла (Ag оксисолі), які виробляють іони Ag1+, Ag2+ та Ag3+ для боротьби з рановою біоплівкою та її впливом на загоєння. Пов'язки Ag1+ мали мінімальний вплив на ранову біоплівку in vitro та на мишах (C57BL/6j). На противагу цьому, оксигеновані солі Ag та пов'язки Ag1+/EDTA/BC значно зменшили кількість життєздатних бактерій у біоплівках in vitro та продемонстрували значне зменшення бактеріальних та EPS-компонентів у ранових біоплівках мишей. Ці пов'язки мали різний вплив на загоєння ран, інфікованих біоплівкою, та ран, не інфікованих біоплівкою, причому пов'язки з киснем та солями мали більш сприятливий вплив на реепітелізацію, розмір рани та запалення порівняно з контрольними методами лікування та іншими срібними пов'язками. Різні фізико-хімічні властивості срібних пов'язок можуть мати різний вплив на біоплівку рани та загоєння, і це слід враховувати при виборі пов'язки для лікування ран, інфікованих біоплівкою.
Хронічні рани визначаються як «рани, які не проходять нормальні стадії загоєння вчасно та впорядковано»1. Хронічні рани створюють психологічне, соціальне та економічне навантаження для пацієнтів і системи охорони здоров’я. Щорічні витрати Національної служби охорони здоров’я (NHS) на лікування ран та пов’язаних з ними супутніх захворювань оцінюються в 8,3 мільярда фунтів стерлінгів у 2017–2018 роках. Хронічні рани також є актуальною проблемою у Сполучених Штатах, де Medicare оцінює річну вартість лікування пацієнтів з ранами у 28,1–96,8 мільярда доларів3.
Інфекція є основним фактором, що перешкоджає загоєнню ран. Інфекції часто проявляються у вигляді біоплівок, які присутні у 78% хронічних ран, що не загоюються. Біоплівки утворюються, коли мікроорганізми незворотно прикріплюються до поверхонь, таких як ранові поверхні, і можуть агрегуватися, утворюючи позаклітинні полімерні (EPS) спільноти. Ранова біоплівка пов'язана з посиленою запальною реакцією, що призводить до пошкодження тканин, що може затримати або запобігти загоєнню4. Збільшення пошкодження тканин може бути частково зумовлене підвищеною активністю матриксних металопротеїназ, колагенази, еластази та активних форм кисню5. Крім того, запальні клітини та біоплівки самі є великими споживачами кисню і тому можуть спричиняти локальну гіпоксію тканин, виснажуючи клітини життєво важливим киснем, необхідним для ефективного відновлення тканин6.
Зрілі біоплівки мають високу стійкість до антимікробних засобів, що вимагає агресивних стратегій для контролю інфекцій біоплівок, таких як механічна обробка з подальшим ефективним антимікробним лікуванням. Оскільки біоплівки можуть швидко регенеруватися, ефективні антимікробні засоби можуть знизити ризик повторного утворення після хірургічного очищення рани7.
Срібло все частіше використовується в антимікробних пов'язках і часто використовується як засіб першої лінії лікування хронічних інфікованих ран. Існує багато комерційно доступних срібних пов'язок, кожна з яких містить різний склад, концентрацію та базову матрицю срібла. Досягнення в галузі срібних пов'язок призвели до розробки нових срібних пов'язок. Металева форма срібла (Ag0) є інертною; для досягнення антимікробної ефективності вона повинна втратити електрон, щоб утворити іонне срібло (Ag1+). Традиційні срібні пов'язки містять сполуки срібла або металеве срібло, які при контакті з рідиною розкладаються з утворенням іонів Ag1+. Ці іони Ag1+ реагують з бактеріальною клітиною, видаляючи електрони зі структурних компонентів або критичних процесів, необхідних для виживання. Запатентована технологія призвела до розробки нової сполуки срібла, оксисолей Ag (нітрату срібла, Ag7NO11), яка входить до складу пов'язок для ран. На відміну від традиційного срібла, розкладання кисневмісних солей утворює стани срібла з вищою валентністю (Ag1+, Ag2+ та Ag3+). Дослідження in vitro показали, що низькі концентрації оксигенованих солей срібла ефективніші, ніж одноіонне срібло (Ag1+), проти патогенних бактерій, таких як Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus та Escherichia coli8,9. Інший новий тип срібної пов'язки містить додаткові інгредієнти, а саме: етилендіамінтетраоцтову кислоту (ЕДТА) та бензетоній хлорид (BC), які, як повідомляється, впливають на біоплівку EPS і тим самим збільшують проникнення срібла в біоплівку. Ці нові технології срібла пропонують нові способи впливу на ранові біоплівки. Однак вплив цих антимікробних засобів на ранове середовище та незалежне від інфекції загоєння є важливим для того, щоб вони не створювали несприятливого ранового середовища та не затримували загоєння. Повідомлялося про занепокоєння щодо цитотоксичності срібла in vitro щодо кількох срібних пов'язок10,11. Однак цитотоксичність in vitro ще не перетворилася на токсичність in vivo, і кілька пов'язок Ag1+ продемонстрували хороший профіль безпеки12.
У цій роботі ми досліджували ефективність карбоксиметилцелюлозних пов'язок, що містять нові формули срібла, проти ранової біоплівки in vitro та in vivo. Крім того, було оцінено вплив цих пов'язок на імунні відповіді та загоєння незалежно від інфекції.
Усі використані пов'язки були комерційно доступними. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Кнутсфорд, Велика Британія) – це неантимікробна пов'язка на основі 100% карбоксиметилцелюлози (КМЦ) з гелевим волокном, яка використовувалася як контрольна пов'язка в цьому дослідженні. Були оцінені три антимікробні срібні пов'язки на основі КМЦ, а саме 3M Kerracel Ag (3M, Кнутсфорд, Велика Британія), яка містить 1,7 мас.% оксигенованої солі срібла (Ag7NO11) у вигляді іонів срібла вищої валентності (Ag1+, Ag2+ та Ag3+). Під час розкладання Ag7NO11 утворюються іони Ag1+, Ag2+ та Ag3+ у співвідношенні 1:2:4. Пов'язка Aquacel Ag Extra, що містить 1,2% хлориду срібла (Ag1+) (ConvaTec, Дісайд, Велика Британія) 13 та пов'язка Aquacel Ag + Extra, що містить 1,2% хлориду срібла (Ag1+), ЕДТА та бензетонію хлорид (ConvaTec, Дісайд, Велика Британія) 14.
Штами, використані в цьому дослідженні, були Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Солсбері) та Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Солсбері).
Бактерії вирощували протягом ночі в бульйоні Мюллера-Хінтона (Oxoid, Алтрінчем, Велика Британія). Потім нічну культуру розводили у співвідношенні 1:100 в бульйоні Мюллера-Хінтона та 200 мкл висівали на стерильні циклопорові мембрани Whatman з товщиною 0,2 мкм (Whatman plc, Мейдстоун, Велика Британія) на агарові чашки Мюллера-Хінтона (Sigma-Aldrich Company Ltd, Кент, Велика Британія). Утворення колоніальних біоплівок при 37°C протягом 24 годин. Ці колоніальні біоплівки перевіряли на логарифмічне усаджування.
Розріжте пов'язку на квадратні шматочки площею 3 см² та попередньо змочіть їх стерильною деіонізованою водою. Помістіть пов'язку поверх біоплівки колонії на агаровому чашці. Кожні 24 га біоплівки видаляли, а життєздатні бактерії в біоплівці (КУО/мл) кількісно визначали шляхом серійного розведення (від 10−1 до 10−7) у нейтралізаційному бульйоні Day-Angle (Merck-Millipore). Після 24 годин інкубації при 37°C проводили стандартний підрахунок на чашках з агаром Мюллера-Хінтона. Кожну обробку та часову точку проводили у трьох повторностях, і підрахунок на чашках повторювали для кожного розведення.
Шкіру зі свинячого живота отримують від свиней породи Великий Білий протягом 15 хвилин після забою відповідно до експортних стандартів Європейського Союзу. Шкіру зголюють та очищають спиртовими серветками, потім заморожують при температурі -80°C протягом 24 годин для девіталізації шкіри. Після розморожування шматочки шкіри площею 1 см2 тричі промивають PBS, 0,6% гіпохлоритом натрію та 70% етанолом протягом 20 хвилин щоразу. Перед видаленням епідермісу видаляють залишки етанолу, промиваючи їх тричі у стерильному PBS. Шкіру культивують у 6-лунковому планшеті з нейлоновою мембраною товщиною 0,45 мкм (Merck-Millipore) зверху та 3 абсорбуючими подушечками (Merck-Millipore), що містять 3 мл фетальної бичачої сироватки (Sigma), доповненої 10% модифікованим середовищем Дульбекко (модифіковане середовище Дульбекко – Aldrich Ltd.).
Колоніальні біоплівки вирощували, як описано для досліджень експозиції біоплівки. Після культивування біоплівки на мембрані протягом 72 годин, біоплівку наносили на поверхню шкіри за допомогою стерильної петлі інокуляції, а мембрану видаляли. Потім біоплівку інкубували на дермі свині протягом додаткових 24 годин при температурі 37°C, щоб біоплівка дозріла та прилипла до шкіри свині. Після того, як біоплівка дозріла та прикріпилася, пов'язку площею 1,5 см2, попередньо зволожувану стерильною дистильованою водою, накладали безпосередньо на поверхню шкіри та інкубували при 37°C протягом 24 годин. Життєздатні бактерії візуалізували шляхом фарбування шляхом рівномірного нанесення реагенту для перевірки життєздатності клітин PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Велика Британія) на апікальну поверхню кожного експлантату та інкубації його протягом 5 хвилин. Використовуйте цифрову камеру Leica DFC425 для миттєвого захоплення зображень на мікроскопі Leica MZ8. Ділянки, забарвлені в рожевий колір, були кількісно визначені за допомогою програмного забезпечення Image Pro версії 10 (Media Cybernetics Inc, Роквілл, Меріленд Image-Pro (mediacy.com)). Скануючу електронну мікроскопію проводили, як описано нижче.
Бактерії, вирощені протягом ночі, розводили у співвідношенні 1:100 у бульйоні Мюллера-Хінтона. 200 мкл культури додавали до стерильної циклопорної мембрани Ватмана з товщиною шару 0,2 мкм (Ватман, Мейдстоун, Велика Британія) та висівали на агар Мюллера-Хінтона. Біоплівкові пластини інкубували при 37°C протягом 72 годин для забезпечення утворення зрілої біоплівки.
Після 3 днів дозрівання біоплівки, квадратний бинт площею 3 см2 було розміщено безпосередньо на біоплівці та інкубовано при 37°C протягом 24 годин. Після зняття бинтування з поверхні біоплівки, на поверхню кожної біоплівки протягом 20 секунд додавали 1 мл реагенту життєздатності клітин PrestoBlue (Invitrogen, Waltham, MA). Поверхні висушували, перш ніж реєструвати зміни кольору за допомогою цифрової камери Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, UK).
Підготуйте нічні культури на агарі Мюллера-Хінтона, перенесіть окремі колонії в 10 мл бульйону Мюллера-Хінтона та інкубуйте на шейкері при 37°C (100 об/хв). Після нічної інкубації культуру розбавляли 1:100 у бульйоні Мюллера-Хінтона, та 300 мкл наносили на кільцеву циклопорну мембрану Ватмана з товщиною 0,2 мкм (Whatman International, Мейдстоун, Велика Британія) на агарі Мюллера-Хінтона та інкубували при 37°C протягом 72 годин. Зрілу біоплівку наносили на рану, як описано нижче.
Вся робота з тваринами проводилася в Манчестерському університеті за проектною ліцензією, затвердженою Управлінням добробуту тварин та етичного розгляду (P8721BD27), та відповідно до рекомендацій, опублікованих Міністерством внутрішніх справ згідно з переглянутою угодою ASPA 2012 року. Усі автори дотримувалися рекомендацій щодо прибуття. Для всіх досліджень in vivo використовувалися восьмитижневі миші лінії C57BL/6j (Envigo, Oxon, Велика Британія). Мишей анестезували ізофлураном (Piramal Critical Care Ltd, Вест-Дрейтон, Велика Британія), а їхні спинні поверхні голили та очищали. Потім кожній миші робили ексцизійну рану розміром 2 × 6 мм за допомогою біопсійного пробійника Stiefel (Schuco International, Гертфордшир, Велика Британія). Для ран, інфікованих біоплівкою, нанесіть 72-годинну колоніальну біоплівку, вирощену на мембрані, як описано вище, на дермальний шар рани за допомогою стерильної петлі для інокуляції одразу після травми та видаліть мембрану. Один квадратний сантиметр пов'язки попередньо зволожують стерильною водою для підтримки вологого середовища рани. Пов'язки накладали безпосередньо на кожну рану та покривали плівкою 3M Tegaderm (3M, Бракнелл, Велика Британія) та рідким клеєм Mastisol (Eloquest Healthcare, Ферндейл, Мічиган), нанесеним по краях для забезпечення додаткової адгезії. Бупренорфін (Animalcare, Йорк, Велика Британія) вводили в концентрації 0,1 мг/кг як знеболювальний засіб. Мишей вибраковували через три дні після травми, використовуючи метод Списку 1, та видаляли, розрізали навпіл та зберігали ділянку рани за потреби.
Фарбування гематоксиліном (ThermoFisher Scientific) та еозином (ThermoFisher Scientific) проводили згідно з протоколом виробника. Площу рани та реепітелізацію кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення Image Pro версії 10 (Media Cybernetics Inc, Роквілл, Меріленд).
Зрізи тканин депарафінізували у ксилолі (ThermoFisher Scientific, Лафборо, Велика Британія), регідратували 100–50% етанолом та ненадовго занурювали у деіонізовану воду (ThermoFisher Scientific). Імуногістохімію проводили з використанням набору VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Берлінгем, Каліфорнія) згідно з протоколом виробника. Первинні антитіла до нейтрофілів NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) та макрофагів Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Вокінґем, Велика Британія) розводили 1:100 у блокуючому розчині та додавали до поверхні зрізу, потім додавали 2 антитіла Anti-, VectaStain ABC та набір субстратів Vector Nova Red Peroxidase (HRP) (Vector Laboratories, Берлінгем, Каліфорнія) та контрастно забарвлювали гематоксиліном. Зображення були отримані за допомогою мікроскопа Olympus BX43 та цифрової камери Olympus DP73 (Olympus, Саутенд-он-Сі, Велика Британія).
Зразки шкіри фіксували у 2,5% глутаральдегіді та 4% формальдегіді в 0,1 М HEPES (pH 7,4) протягом 24 годин при 4°C. Зразки зневоднювали за допомогою градуйованого етанолу та сушили в CO2 за допомогою сушарки критичних точок Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Лафтон, Велика Британія) та наносили на них розпилення із золото-паладієвого сплаву за допомогою міні-системи розпилення/тліючого розряду Quorum SC7620. Зразки фотографували за допомогою скануючого електронного мікроскопа FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) для візуалізації центральної точки рани.
Тото-1 йодид (2 мкМ) наносили на видалену поверхню рани миші та інкубували протягом 5 хвилин при 37 °C (ThermoFisher Scientific), а потім обробляли Syto-60 (10 мкМ) при 37 °C (ThermoFisher Scientific). 15-хвилинні Z-стекові зображення створювали за допомогою Leica TCS SP8.
Біологічні та технічні дані повторних досліджень були зведені в таблицю та проаналізовані за допомогою програмного забезпечення Graphpad Prism V9 (GraphPad Software, Ла-Хойя, Каліфорнія). Для перевірки відмінностей між кожним методом лікування та контрольною пов'язкою без антимікробного засобу було використано однофакторний дисперсійний аналіз з множинними порівняннями з використанням постфактумного тесту Даннета. Значення p < 0,05 вважалося значущим.
Ефективність волокнистих пов'язок зі срібним гелем вперше оцінювали на колоніях біоплівки Staphylococcus aureus та Pseudomonas aeruginosa in vitro. Срібні пов'язки містять різні формули срібла: традиційні срібні пов'язки виробляють іони Ag1+; срібні пов'язки, які можуть виробляти іони Ag1+ після додавання ЕДТА/BC, можуть руйнувати матрицю біоплівки та піддавати бактерії впливу срібла під антибактеріальним ефектом іонів срібла15, а також пов'язки, що містять кисневі солі Ag, які виробляють іони Ag1+, Ag2+ та Ag3+. Його ефективність порівнювали з неантимікробною контрольною пов'язкою, виготовленою з гелевих волокон. Кількість життєздатних бактерій, що залишилися в біоплівці, оцінювали кожні 24 години протягом 8 днів (Рисунок 1). На 5-й день біоплівку повторно інокулювали 3,85 × 105S Staphylococcus aureus або 1,22×105P. aeruginosa для оцінки відновлення біоплівки. Порівняно з контрольними пов'язками без антимікробного засобу, пов'язки з Ag1+ мали мінімальний вплив на життєздатність бактерій у біоплівках Staphylococcus aureus та Pseudomonas aeruginosa протягом 5 днів. Натомість, пов'язки, що містили оксигенований Ag та солі Ag1+ + EDTA/BC, були ефективними у знищенні бактерій у біоплівці протягом 5 днів. Після повторної інокуляції планктонними бактеріями на 5-й день відновлення біоплівки не спостерігалося (рис. 1).
Кількісне визначення життєздатних бактерій у біоплівках Staphylococcus aureus та Pseudomonas aeruginosa після обробки срібними пов'язками. Колонії біоплівок Staphylococcus aureus та Pseudomonas aeruginosa обробляли срібними пов'язками або контрольними пов'язками без антимікробного складу, а кількість життєздатних бактерій, що залишилися, визначали кожні 24 години. Через 5 днів біоплівку повторно інокулювали 3,85×105S. Staphylococcus aureus або 1,22×105P. Колонії бактеріопланктону Pseudomonas aeruginosa формували окремо для оцінки відновлення біоплівки. Графіки показують середнє значення +/- стандартну похибку.
Щоб візуалізувати вплив срібних пов'язок на життєздатність біоплівки, пов'язки накладали на зрілі біоплівки, вирощені на шкірі свині ex vivo. Через 24 години пов'язку видаляли, а біоплівку забарвлювали синім реактивним барвником, який метаболізується живими бактеріями до рожевого кольору. Біоплівки, оброблені контрольними пов'язками, були рожевими, що свідчить про наявність життєздатних бактерій у біоплівці (Рисунок 2A). На противагу цьому, біоплівка, оброблена пов'язкою Ag oxysols, була переважно синьою, що вказує на те, що решта бактерій на поверхні шкіри свині були нежиттєздатними (Рисунок 2B). Змішане синє та рожеве забарвлення спостерігалося в біоплівках, оброблених пов'язками, що містять Ag1+, що вказує на наявність життєздатних та нежиттєздатних бактерій у біоплівці (Рисунок 2C), тоді як пов'язки EDTA/BC, що містили Ag1+, були переважно синіми з деякими рожевими плямами, що вказує на ділянки, на які не впливала срібна пов'язка (Рисунок 2D). Кількісне визначення активних (рожевих) та неактивних (синіх) ділянок показало, що контрольна ділянка була на 75% активною (Рисунок 2E). Пов'язки Ag1+ + EDTA/BC діяли аналогічно пов'язкам з киснево насиченими солями Ag, з показниками виживання 13% та 14% відповідно. Пов'язка Ag1+ також знизила життєздатність бактерій на 21%. Ці біоплівки потім спостерігали за допомогою скануючої електронної мікроскопії (СЕМ). Після обробки контрольною пов'язкою та пов'язкою Ag1+ спостерігався шар Pseudomonas aeruginosa, що покривав шкіру свині (Рисунок 2F,H), тоді як після обробки пов'язкою Ag1+ було виявлено мало бактеріальних клітин і мало бактеріальних клітин під ними. Колагенові волокна можна розглядати як тканинну структуру шкіри свині (Рисунок 2G). Після обробки пов'язкою Ag1+ + EDTA/BC були видимі бактеріальні бляшки та бляшки з колагенових волокон, що лежать під ними (Рисунок 2I).
Візуалізація біоплівки Pseudomonas aeruginosa після обробки срібною пов'язкою. (A–D) Бактеріальну життєздатність у біоплівках Pseudomonas aeruginosa, вирощених на шкірі свині, візуалізували за допомогою барвника PrestoBlue через 24 години після обробки срібними пов'язками або контрольними пов'язками без антимікробного забарвлення. Живі бактерії рожеві, нежиттєздатні бактерії та шкіра свині – сині. (E) Кількісне визначення біоплівок Pseudomonas aeruginosa, вирощених на шкірі свині (рожева пляма), за допомогою скануючої електронної мікроскопії Image Pro версії 10 (FI) та оброблених срібною пов'язкою або контрольною пов'язкою без антимікробного забарвлення протягом 24 годин. Масштабна шкала SEM = 5 мкм. (J–M) Колоніальні біоплівки виросли на фільтрах та забарвлювали реактивним барвником PrestoBlue після 24 годин інкубації зі срібними пов'язками.
Щоб визначити, чи впливає тісний контакт між пов'язками та біоплівками на ефективність пов'язок, колоніальні біоплівки, розміщені на плоскій поверхні, обробляли пов'язками протягом 24 годин, а потім забарвлювали реактивними барвниками. Необроблена біоплівка мала темно-рожевий колір (Рисунок 2J). На відміну від біоплівок, оброблених пов'язками, що містять кисневі солі Ag (Рисунок 2K), біоплівки, оброблені пов'язками, що містять Ag1+ або Ag1+ + EDTA/BC, демонстрували смуги рожевого забарвлення (Рисунок 2L,M). Це рожеве забарвлення вказує на наявність життєздатних бактерій і пов'язане з ділянкою шва всередині пов'язки. Ці зшиті ділянки створюють мертві простори, які дозволяють бактеріям всередині біоплівки виживати.
Для оцінки ефективності срібних пов'язок in vivo, повнорозмірні видалені рани мишей, інфікованих зрілими біоплівками S. aureus та P. aeruginosa, обробляли контрольними пов'язками без антимікробних речовин або срібними пов'язками. Через 3 дні лікування макроскопічний аналіз зображень показав менші розміри ран при обробці кисневими сольовими пов'язками порівняно з контрольними пов'язками без антимікробних речовин та іншими срібними пов'язками (Рисунок 3A-H). Для підтвердження цих спостережень рани були зібрані, а площа рани та реепітелізація були кількісно визначені на зрізах тканин, забарвлених гематоксиліном та еозином, за допомогою програмного забезпечення image pro версії 10 (Рисунок 3I-L).
Вплив срібних пов'язок на поверхню рани та реепітелізація ран, інфікованих біоплівками. (A–H) Дрібні клітини, інфіковані біоплівками Pseudomonas aeruginosa (A–D) та Staphylococcus aureus (E–H) після трьох днів лікування неантимікробною контрольною пов'язкою, пов'язкою з киснево насиченою сіллю Ag, пов'язкою Ag1+ та пов'язкою Ag1+. Типові макроскопічні зображення. Рани мишей з пов'язкою Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Типова інфекція Pseudomonas aeruginosa, гістологічні зрізи, забарвлені гематоксиліном та еозином, що використовуються для кількісної оцінки площі рани та регенерації епітелію. Кількісна оцінка площі рани (M, O) та відсотка реепітелізації (N, P) ран, інфікованих біоплівками Pseudomonas aeruginosa (M, N) та Staphylococcus aureus (O, P) (на групу лікування n = 12). Графіки показують середнє значення +/- стандартну похибку. * означає p = < 0,05 ** означає p = < 0,01; Макроскопічний масштаб = 2,5 мм, гістологічний масштаб = 500 мкм.
Кількісна оцінка площі рани в ранах, інфікованих біоплівкою Pseudomonas aeruginosa (Рисунок 3M), показала, що рани, оброблені оксисолями срібла, мали середній розмір рани 2,5 мм2, тоді як контрольна пов'язка без антимікробного засобу мала середній розмір рани 3,1 мм2, що не відповідає дійсності. Дослідження досягло статистичної значущості (Рисунок 3M). p = 0,423). Рани, оброблені Ag1+ або Ag1+ + EDTA/BC, не показали зменшення площі рани (3,1 мм2 та 3,6 мм2 відповідно). Обробка пов'язкою з киснево насиченою сіллю срібла сприяла реепітелізації більшою мірою, ніж контрольна пов'язка без антимікробного засобу (34% та 15% відповідно; p = 0,029) та Ag1+ або Ag1+ + EDTA/BC (10% та 11%) (Рисунок 3N).
Подібні тенденції щодо площі рани та регенерації епітелію спостерігалися в ранах, інфікованих біоплівками S. aureus (Рисунок 3O). Пов'язки, що містять кисневі солі срібла, зменшили площу рани (2,0 мм2) на 23% порівняно з контрольною неантимікробною пов'язкою (2,6 мм2), хоча це зменшення було незначним (p = 0,304) (Рисунок 3O). Крім того, площа рани в групі лікування Ag1+ дещо зменшилася (2,4 мм2), тоді як рана, оброблена пов'язкою Ag1+ + EDTA/BC, не зменшила площу рани (2,9 мм2). Кисневі солі Ag також сприяли реепітелізації ран, інфікованих біоплівкою S. aureus (31%), більшою мірою, ніж ті, що оброблені неантимікробними контрольними пов'язками (12%, p = 0,003) (Рисунок 3P). Пов'язка Ag1+ (16%, p = 0,903) та пов'язка Ag+1 + EDTA/BC (14%, p = 0,965) показали рівні регенерації епітелію, подібні до контрольної групи.
Для візуалізації впливу срібних пов'язок на матрицю біоплівки було проведено фарбування йодидом Toto 1 та Syto 60 (рис. 4). Йодид Toto 1 – це барвник, непроникний для клітин, який можна використовувати для точної візуалізації позаклітинних нуклеїнових кислот, яких багато в позаклітинному полімерному наповнювачі (EPS) біоплівок. Syto 60 – це барвник, проникний для клітин, який використовується як контрастний барвник16. Спостереження за йодидом Toto 1 та Syto 60 у ранах, інокульованих біоплівками Pseudomonas aeruginosa (рис. 4A-D) та Staphylococcus aureus (рис. 4I-L), показали, що після 3 днів обробки пов'язками EPS у біоплівці значно зменшився, включаючи пов'язки, що містять кисневі солі Ag та Ag1+ + EDTA/BC. Пов'язки Ag1+ без додаткових антибіоплівкових компонентів значно зменшили безклітинну ДНК у ранах, інокульованих Pseudomonas aeruginosa, але були менш ефективними у ранах, інокульованих Staphylococcus aureus.
Візуалізація ранової біоплівки in vivo після 3 днів лікування контрольними або срібними пов'язками. Конфокальні зображення Pseudomonas aeruginosa (A–D) та Staphylococcus aureus (I–L), забарвлених Toto 1 (зелений), для візуалізації позаклітинних нуклеїнових кислот, компонента полімерів позаклітинної біоплівки. Для забарвлення внутрішньоклітинних нуклеїнових кислот використовуйте Syto 60 (червоний). кислоти. P. Скануюча електронна мікроскопія ран, інфікованих біоплівками Pseudomonas aeruginosa (E–H) та Staphylococcus aureus (M–P), після 3 днів лікування контрольними та срібними пов'язками. Масштабна шкала SEM = 5 мкм. Масштабна шкала конфокальної візуалізації = 50 мкм.
Скануюча електронна мікроскопія показала, що у мишей, яким вводили колонії біоплівки Pseudomonas aeruginosa (Рисунок 4E-H) та Staphylococcus aureus (Рисунок 4M-P), після 3 днів лікування повністю срібними пов'язками спостерігалося значно менше бактерій у ранах.
Щоб оцінити вплив срібних пов'язок на запалення ран у мишей, інфікованих біоплівкою, зрізи ран, інфікованих біоплівкою, оброблених контрольними або срібними пов'язками протягом 3 днів, були імуногістохімічно забарвлені з використанням антитіл, специфічних для нейтрофілів та макрофагів. Кількісне визначення нейтрофілів та макрофагів всередині. грануляційної тканини. Рисунок 5). Всі срібні пов'язки зменшили кількість нейтрофілів та макрофагів у ранах, інфікованих Pseudomonas aeruginosa, порівняно з контрольними пов'язками без антимікробного засобу після трьох днів лікування. Однак, лікування пов'язкою з киснево насиченою сіллю срібла призвело до більшого зниження кількості нейтрофілів (p = <0,0001) та макрофагів (p = <0,0001) порівняно з іншими протестованими срібними пов'язками (Рисунок 5I,J). Хоча Ag1+ + EDTA/BC мали більший вплив на раневу біоплівку, вони знижували рівень нейтрофілів та макрофагів меншою мірою, ніж пов'язка Ag1+. Помірні рани, інфіковані біоплівкою S. aureus, також спостерігалися після накладання пов'язок з оксизолями Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) та Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) порівняно з контролем. Подібні тенденції спостерігаються для пов'язки при нейтропенії (рис. 5K). Однак, лише пов'язка з киснево насиченою сіллю Ag показала значне зменшення кількості макрофагів у грануляційній тканині порівняно з контролем у ранах, інфікованих біоплівками S. aureus (p = 0,0339) (рис. 5L).
Нейтрофіли та макрофаги кількісно визначали в ранах, інфікованих біоплівками Pseudomonas aeruginosa та Staphylococcus aureus, після 3 днів лікування контрольними пов'язками без антимікробного препарату або срібними пов'язками. Нейтрофіли (AD) та макрофаги (EH) кількісно визначали в зрізах тканин, забарвлених антитілами, специфічними для нейтрофілів або макрофагів. Кількісне визначення нейтрофілів (I та K) та макрофагів (J та L) у ранах, інфікованих біоплівками Pseudomonas aeruginosa (I та J) та Staphylococcus aureus (K та L). N = 12 на групу. Графіки показують середнє значення +/- стандартну похибку, значення значущості порівняно з контрольною пов'язкою без антибактеріального препарату, * означає p = < 0,05, ** означає p = < 0,01; *** означає p = < 0,001; вказує на p = < 0,0001).
Потім ми оцінили вплив срібних пов'язок на загоєння, незалежне від інфекції. Неінфіковані ексцизійні рани обробляли контрольною пов'язкою без антимікробного засобу або срібною пов'язкою протягом 3 днів (Рисунок 6). Серед протестованих срібних пов'язок лише рани, оброблені пов'язкою з киснем та сіллю, виглядали меншими на макроскопічних зображеннях, ніж рани, оброблені контрольною групою (Рисунок 6A-D). Кількісна оцінка площі рани за допомогою гістологічного аналізу показала, що середня площа рани після обробки пов'язкою Ag oxysols становила 2,35 мм2 порівняно з 2,96 мм2 для ран, оброблених контрольною групою, але ця різниця не досягла статистичної значущості (p = 0,488) (Рис. 6I). Натомість, зменшення площі рани після обробки пов'язками Ag1+ (3,38 мм2, p = 0,757) або Ag1+ + EDTA/BC (4,18 мм2, p = 0,054) порівняно з контрольною групою не спостерігалося. Спостерігалося збільшення регенерації епітелію при використанні пов'язки з Ag оксизолем порівняно з контрольною групою (30% проти 22% відповідно), хоча це не досягло значущості (p = 0,067), це досить суттєво та підтверджує попередні результати. Пов'язка з оксизолями сприяє реепітелізації. -Епітелізація неінфікованих ран17. На противагу цьому, лікування пов'язками Ag1+ або Ag1+ + EDTA/BC не мало ефекту або показало знижену реепітелізацію порівняно з контролем.
Вплив срібної пов'язки на загоєння ран у неінфікованих мишей з повною резекцією. (AD) Типові макроскопічні зображення ран після трьох днів лікування неантимікробною контрольною пов'язкою та срібною пов'язкою. (EH) Типові зрізи рани, забарвлені гематоксиліном та еозином. Кількісну оцінку площі рани (I) та відсоток реепітелізації (J) розраховували з гістологічних зрізів у середині рани за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень (n = 11–12 на групу лікування). Графіки показують середнє значення +/- стандартну похибку. * означає p = <0,05.
Срібло має довгу історію використання як антимікробної терапії для загоєння ран, але безліч різних рецептур та методів доставки можуть призводити до різниці в антимікробній ефективності 18. Більше того, властивості антибіоплівки специфічних систем доставки срібла до кінця не вивчені. Хоча імунна відповідь господаря є відносно ефективною проти планктонних бактерій, вона, як правило, менш ефективна проти біоплівок 19. Планктонні бактерії легко фагоцитуються макрофагами, але всередині біоплівок агреговані клітини створюють додаткові проблеми, обмежуючи відповідь господаря до такої міри, що імунні клітини можуть зазнавати апоптозу та вивільняти прозапальні фактори для посилення імунної відповіді 20. Було помічено, що деякі лейкоцити можуть проникати крізь біоплівки 21, але не здатні фагоцитувати бактерії, як тільки цей захист порушений 22. Для підтримки імунної відповіді господаря проти інфекції ранової біоплівки слід використовувати цілісний підхід. Очищення рани може фізично порушити біоплівку та видалити більшу частину біонавантаження, але імунна відповідь господаря може бути неефективною проти залишкової біоплівки, особливо якщо імунна відповідь господаря порушена. Таким чином, антимікробна терапія, така як срібні пов'язки, може підтримувати імунну відповідь хазяїна та усувати біоплівкові інфекції. Склад, концентрація, розчинність та субстрат доставки можуть впливати на антимікробну ефективність срібла. В останні роки досягнення в технології обробки срібла зробили ці пов'язки більш ефективними9,23. З розвитком технології срібних пов'язок важливо розуміти ефективність цих пов'язок у контролі ранової інфекції та, що ще важливіше, вплив цих потужних форм срібла на середовище рани та загоєння.
У цьому дослідженні ми порівняли ефективність двох удосконалених срібних пов'язок зі звичайними срібними пов'язками, що виробляють іони Ag1+ проти біоплівок, використовуючи різні моделі in vitro та in vivo. Ми також оцінили вплив цих пов'язок на раневе середовище та загоєння, незалежне від інфекції. Щоб мінімізувати вплив матриці доставки, всі протестовані срібні пов'язки складалися з карбоксиметилцелюлози.
Наша попередня оцінка цих срібних пов'язок проти колоніальних біоплівок Pseudomonas aeruginosa та Staphylococcus aureus показує, що, на відміну від традиційних пов'язок Ag1+, дві вдосконалені срібні пов'язки, Ag1+ + EDTA/BC та кисневі солі Ag, ефективні при 5. Ефективно знищуючи бактерії біоплівки протягом кількох днів. Крім того, ці пов'язки запобігають повторному утворенню біоплівки при багаторазовому впливі планктонних бактерій. Пов'язка Ag1+ містила хлорид срібла, ту саму сполуку срібла та базову матрицю, що й Ag1+ + EDTA/BC, і мала обмежений вплив на життєздатність бактерій у біоплівці протягом того ж періоду. Спостереження, що пов'язка Ag1+ + EDTA/BC була ефективнішою проти біоплівки, ніж пов'язка Ag1+, що складається з тієї ж матриці та сполуки срібла, підтверджує припущення, що для підвищення ефективності хлориду срібла проти біоплівки необхідні додаткові інгредієнти, як повідомлялося в інших дослідженнях15. Ці результати підтверджують ідею про те, що BC та EDTA відіграють додаткову роль, сприяючи загальній ефективності пов'язки, і що відсутність цього компонента в пов'язках Ag1+ могла сприяти нездатності продемонструвати ефективність in vitro. Ми виявили, що пов'язки з кисневими солями Ag, які продукують іони Ag2+ та Ag3+, демонструють сильнішу антибактеріальну ефективність, ніж Ag1+, і на рівнях, подібних до Ag1+ + EDTA/BC. Однак через високий окисно-відновний потенціал незрозуміло, як довго іони Ag3+ залишаються активними та ефективними проти ранових біоплівок, і тому заслуговують на подальше дослідження. Крім того, існує багато різних пов'язок, які генерують іони Ag1+, які не були протестовані в цьому дослідженні. Ці пов'язки складаються з різних сполук срібла, концентрацій та базових матриць, що може впливати на доставку іонів Ag1+ та їх ефективність проти біоплівок. Варто також зазначити, що існує багато різних моделей in vitro та in vivo, які використовуються для оцінки ефективності ранових пов'язок проти біоплівок. Тип використовуваної моделі, а також вміст солі та білка в середовищі, що використовується в цих моделях, впливатимуть на ефективність пов'язки. У нашій моделі in vivo ми дозволили біоплівці дозріти in vitro, а потім перенесли її на поверхню дерми рани. Імунна відповідь миші-хазяїна є відносно ефективною проти планктонних бактерій, нанесених на рану, тим самим утворюючи біоплівку під час загоєння рани. Додавання зрілої біоплівки до рани обмежує ефективність імунної відповіді хазяїна на утворення біоплівки, дозволяючи зрілій біоплівці закріпитися в рані до початку загоєння. Таким чином, наша модель дозволяє нам оцінити ефективність антимікробних пов'язок на зрілих біоплівках до того, як рани почнуть загоюватися.
Ми також виявили, що прилягання пов'язки впливає на ефективність срібних пов'язок на біоплівках, вирощених in vitro, та шкірі свиней. Тісний контакт з раною вважається критично важливим для антимікробної ефективності пов'язки24,25. Пов'язки, що містять кисневі солі Ag, тісно контактували зі зрілими біоплівками, що призводило до значного зменшення кількості життєздатних бактерій у біоплівці через 24 години. Натомість, при обробці пов'язками Ag1+ та Ag1+ + EDTA/BC залишалася значна кількість життєздатних бактерій. Ці пов'язки містять шви по всій довжині пов'язки, що створює мертві простори, що перешкоджають тісному контакту з біоплівкою. У наших дослідженнях in vitro ці неконтактні ділянки запобігали знищенню життєздатних бактерій у біоплівці. Ми оцінювали життєздатність бактерій лише після 24 годин обробки; З часом, коли пов'язка стає більш насиченою, мертвого простору може бути менше, що зменшує площу для цих життєздатних бактерій. Однак це підкреслює важливість складу пов'язки, а не лише типу срібла в пов'язці.
Хоча дослідження in vitro корисні для порівняння ефективності різних срібних технологій, також важливо розуміти вплив цих пов'язок на біоплівки in vivo, де тканини господаря та імунна відповідь сприяють ефективності пов'язок проти біоплівок. Вплив цих пов'язок на ранові біоплівки спостерігали за допомогою скануючої електронної мікроскопії та фарбування біоплівки EPS з використанням внутрішньоклітинних та позаклітинних ДНК-барвників. Ми виявили, що після 3 днів лікування всі пов'язки були ефективними у зменшенні безклітинної ДНК у ранах, інфікованих біоплівкою, але пов'язка Ag1+ була менш ефективною у ранах, інфікованих Staphylococcus aureus. Скануюча електронна мікроскопія також показала, що в ранах, оброблених срібними пов'язками, було присутньо значно менше бактерій, хоча це було більш виражено для пов'язки з киснево насиченою сіллю Ag та пов'язки Ag1+ + EDTA/BC порівняно з пов'язкою Ag1+. Ці дані показують, що протестовані срібні пов'язки мали різний ступінь впливу на структуру біоплівки, але жодна зі срібних пов'язок не змогла знищити біоплівку, що підтверджує необхідність цілісного підходу до лікування інфекцій ранових біоплівок; використання срібних пов'язок. Лікуванню передує фізична санація рани для видалення більшої частини біоплівки.
Хронічні рани часто перебувають у стані сильного запалення, при цьому надлишок запальних клітин залишається в тканині рани протягом тривалого періоду часу, що призводить до пошкодження тканин і виснаження кисню, необхідного для ефективного клітинного метаболізму та функціонування в рані26. Біоплівки посилюють це вороже середовище рани, негативно впливаючи на загоєння різними способами, включаючи пригнічення проліферації та міграції клітин та активацію прозапальних цитокінів27. Оскільки срібні пов'язки стають більш ефективними, важливо розуміти їхній вплив на середовище рани та загоєння.
Цікаво, що хоча всі срібні пов'язки впливали на склад біоплівки, лише пов'язки з киснево насиченими солями срібла збільшували реепітелізацію цих інфікованих ран. Ці дані підтверджують наші попередні висновки17 та висновки Калана та ін. (2017)28, які продемонстрували хороші профілі безпеки та токсичності киснево насичених солей срібла, оскільки нижчі концентрації срібла були ефективними проти біоплівок.
Наше поточне дослідження підкреслює відмінності в технології срібла між антимікробними срібними пов'язками та вплив цієї технології на раневе середовище та загоєння, незалежне від інфекції. Однак ці результати відрізняються від попередніх досліджень, які показали, що пов'язка Ag1+ + EDTA/BC покращила параметри загоєння пошкоджених вух кроликів in vivo. Однак це може бути пов'язано з відмінностями в моделях на тваринах, часом вимірювань та методами нанесення бактерій29. У цьому випадку вимірювання рани проводилися через 12 днів після травми, щоб активні інгредієнти пов'язки могли діяти на біоплівку протягом тривалішого періоду часу. Це підтверджується дослідженням, яке показало, що клінічно інфіковані виразки на ногах, оброблені Ag1+ + EDTA/BC, спочатку збільшувалися в розмірах після одного тижня лікування, а потім протягом наступних 3 тижнів лікування Ag1+ + EDTA/BC та протягом 4 тижнів використання неантимікробних препаратів. пов'язки CMC для зменшення розміру виразок30.
Раніше було показано, що певні форми та концентрації срібла є цитотоксичними in vitro 11, але ці результати in vitro не завжди призводять до побічних ефектів in vivo. Крім того, досягнення в технології використання срібла та краще розуміння сполук срібла та їх концентрацій у пов'язках призвели до розробки багатьох безпечних та ефективних срібних пов'язок. Однак, з розвитком технології срібних пов'язок важливо розуміти вплив цих пов'язок на раневе середовище 31, 32, 33. Раніше повідомлялося, що підвищена швидкість реепітелізації відповідає збільшеній частці протизапальних макрофагів M2 порівняно з прозапальним фенотипом M1. Це було відзначено в попередній моделі на мишах, де ранові пов'язки на основі гідрогелю срібла порівнювали з сульфадіазином срібла та неантимікробними гідрогелями 34.
Хронічні рани можуть демонструвати надмірне запалення, і було відзначено, що наявність надлишку нейтрофілів може негативно впливати на загоєння ран35. У дослідженні на мишах з дефіцитом нейтрофілів було виявлено, що наявність нейтрофілів уповільнює реепітелізацію. Наявність надлишку нейтрофілів призводить до високого рівня протеаз та активних форм кисню, таких як супероксид та перекис водню, які пов'язані з хронічними та повільно загоюваними ранами37,38. Аналогічно, збільшення кількості макрофагів, якщо його не контролювати, може призвести до уповільнення загоєння ран39. Це збільшення особливо важливе, якщо макрофаги не здатні перейти від прозапального фенотипу до прозагоювального фенотипу, що призводить до того, що рани не виходять із запальної фази загоєння40. Ми спостерігали зменшення кількості нейтрофілів та макрофагів у ранах, інфікованих біоплівкою, після 3 днів лікування всіма срібними пов'язками, але зниження було більш вираженим при використанні киснево-сольових пов'язок. Це зниження може бути прямим результатом імунної відповіді на срібло, реакції на зменшення біонавантаження або того, що рана перебуває на пізнішій стадії загоєння, а отже, і кількості імунних клітин у рані. Зменшення кількості запальних клітин у рані може підтримувати середовище, сприятливе для загоєння ран. Механізм дії оксисолей срібла (Ag oxysoli) для сприяння загоєнню, незалежному від інфекції, незрозумілий, але здатність оксисолей срібла виробляти кисень і руйнувати шкідливі рівні перекису водню, медіатора запалення, може пояснити це і потребує подальшого вивчення17.
Хронічні незагойні інфіковані рани створюють проблему як для лікарів, так і для пацієнтів. Хоча багато пов'язок заявляють про антимікробну ефективність, дослідження рідко зосереджуються на інших ключових факторах, що впливають на мікрооточення рани. Це дослідження показує, що різні технології срібла мають різну антимікробну ефективність і, що важливо, різний вплив на середовище рани та загоєння, незалежно від інфекції. Хоча ці дослідження in vitro та in vivo показують ефективність цих пов'язок у лікуванні ранових інфекцій та сприянні загоєнню, для оцінки ефективності цих пов'язок у клініці необхідні рандомізовані контрольовані дослідження.
Набори даних, використані та/або проаналізовані під час поточного дослідження, доступні у відповідного автора за обґрунтованим запитом.
Час публікації: 15 липня 2024 р.